主要用途
细胞AMPK激酶活性比色法定量检测试剂是一种旨在通过多肽底物受到AMPK磷酸化后，进而由丙酮酸激酶和乳酸脱氢酶连续循环法反应系统，测定产生ADP过程中，伴随的还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）的氧化反应， 即采用比色法测定其氧化后峰值的变化，以分析细胞裂解样品中AMPK活性的权威而经典的技术方法。该技术由大师级科学家精心研制、成功实验证明的。其适用于各种细胞裂解萃取液样品（动物、人体）、部分或完全纯化酶样品中AMPK激酶的定量检测，以及抑制剂和激活剂的筛选。产品严格无菌，即到即用，操作简捷，性能稳定，高度敏感。
技术背景
5’AMP活化蛋白激酶（5’AMP activated protein kinase；AMPK）属于丝氨酸/苏氨酸激酶（serine/threonine protein kinase）家属成员之一。其为从酵母到人体高度进化保留的激酶复合物，由3个亚体，α、β、γ构成：其中γ亚体有4个胱硫醚β合酶（cystathione beta synthase；CBS）结构域，又称为巴特曼（Bateman）结构域，以探测AMP和ATP的比例；α亚体含有催化结构域，一旦收到AMPKK或LKB1/MO25/STRAD 复合物催化的磷酸化后，AMPK被激活。所有亚体都有不同异构体形式，包括α1、α2、β1、β2、γ1、γ2和γ3。其功能在于保持细胞能量内环境恒定：促进脂肪酸β氧化、抑制胆固醇合成、促进肌肉葡萄糖吸收和调节胰岛素分泌等。AMPK在肝脏、脑和肌肉组织中高度表达。其磷酸化目标序列为 XXXXXXXXXXXX。基于底物XXXXXXXXXXXX，在ATP的存在下，受到5’AMP活化蛋白激酶的磷酸化，获得产物磷酸化多肽，进而通过丙酮酸激酶（pyruvate kinase；PK）和乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase；LDH）反应系统中，还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（reduced nicotinamide adenine dinucleotide；NADH）转化为氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide；NAD），其峰值的变化（340nm），来定量分析5’AMP活化蛋白激酶的活性。其反应方式为：
产品内容
清理液（Reagent A） 毫升
裂解液（Reagent B） 毫升
缓冲液（Reagent C） 毫升
酶促液（Reagent D） 微升
反应液（Reagent E） 微升
底物液（Reagent F） 微升
阴性液（Reagent G） 微升
产品说明书 1份
保存方式
保存清理液（Reagent A）在4℃冰箱里；其余的保存在－20℃冰箱里，严格避免光照和反复冻融；有效保证6月
用户自备
1.5毫升离心管：用于样品保存的容器
15毫升锥形离心管：用于样品处理的容器
细胞刮脱棒：用于贴壁细胞脱离
（微型）台式离心机：用于细胞预处理
比色皿或酶标板：用于比色分析操作的容器
分光光度仪或酶标仪：用于样品比色分析
实验步骤
一、待测样品准备
1．准备好25cm2细胞培养瓶或60mm细胞培养皿的待测培养细胞（1至5 X 106细胞）
2．小心加入3毫升清理液（Reagent A），覆盖生长表面
3．小心抽去清理液
4．使用细胞刮脱棒轻柔刮脱细胞（注意：避免使用胰酶消化）
5．加入3毫升清理液（Reagent A），混匀细胞
6．移入到预冷的15毫升锥形离心管（注意：悬浮细胞从这一步骤开始）
7．放进4℃台式离心机离心5分钟，速度为300g
8．小心抽去上清液
9．加入500微升裂解液（Reagent B），充分混匀
10．转移到预冷的1.5毫升离心管
11．强力涡旋震荡15秒
12．置于冰槽里孵育30分钟
13．放进4℃微型台式离心机离心5分钟，速度为16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）
14．小心移取500微升上清液到新的预冷的1.5毫升离心管
15．移取10微升进行蛋白定量检测（注意：建议使用 Bradford蛋白质浓度定量试剂盒－G&VS30030.1）
16．即刻放进－70℃保存或置于冰槽里继续后续操作
二、测定准备
1．准备好待测样品（例如组织裂解悬液等），置于冰槽里
2．设定好分光光度仪（温度为30℃）：波长为340nm，间隔5分钟，读数7次（共30分钟），并置零
三、背景对照测定
1．移取65微升缓冲液（Reagent C）到新的比色皿
2．加入10微升酶促液（Reagent D）
3．加入5微升阴性液（Reagent G）
4．放进30℃培养箱里静置2分钟
5．（选择步骤）放进分光光度仪，置零
6．（选择步骤）取出比色皿
7．加入10微升反应液（Reagent E）
8．加入10微升底物液（Reagent F）
9．上下倾倒数次，混匀（限定在3秒之内）
10．即刻放进分光光度仪检测，此为背景空对照：340波长读数0分钟 －340波长读数30分钟
四、样品测定
1．移取65微升缓冲液（Reagent C）到新的比色皿
2．加入10微升酶促液（Reagent D）
3．加入5微升待测样品（注意：50微克组织蛋白；样品须溶解）
4．放进30℃培养箱里静置2分钟
5．（选择步骤）放进分光光度仪，置零
6．（选择步骤）取出比色皿
7．加入10微升反应液（Reagent E）
8．加入10微升底物液（Reagent F）
9．上下倾倒数次，混匀（限定在3秒之内）
10．即刻放进分光光度仪检测，此为样品读数：340波长读数0分钟 －340波长读数30分钟
五、计算样品活性
六、酶标板测定
1．在96孔酶标板上做好相应标记：背景对照和样品
2．分别移取65微升缓冲液（Reagent C）到96孔板中
3．分别加入10微升酶促液（Reagent D）
4．分别加入5微升阴性液（Reagent G）或待测样品（50微克组织蛋白）到相应孔中（注意：样品须清澈）
5．轻轻摇动96孔酶标板
6．在30℃温度下孵育2分钟
7．分别加入10微升反应液（Reagent E）
8．分别加入10微升底物液（Reagent F）
9．轻轻摇动酶标板
10．即刻放进酶标仪检测：0分钟读数和30分钟读数
11．活性计算：
注意事项
1．本产品为20次操作，包括背景操作
2．操作时，须戴手套
3．系统操作过程中，背景测定只需1次
4．样品处理忌用磷酸缓冲溶液
5．样品须澄清，至关重要
6．加入底物液（Reagent F）后3秒内即刻比色测定
7．测定值由高到低变化；测定可持续30分钟
8．比色测定后，比色皿须清洗彻底
9．样本测定0分钟读数高于30分钟读数表明具有酶活性
10．建议待测样本蛋白浓度为50微克/5微升（本公司提供 Bradford蛋白质浓度定量试剂盒－G&VS30030.1）
11．如果待测样品浓度过高或过低，可以调整样品浓度
12．可以使用AMPK抑制剂（DORSOMORPHIN）作为抑制剂对照或阴性对照
13．5’AMP活化蛋白激酶活性单位浓度定义：在30℃温度下，pH 7.5条件下，每分钟内能够氧化1微摩尔还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）所需的酶量作为一个活性单位
14．本公司提供系列蛋白激酶检测试剂产品
质量标准
1．本产品经鉴定性能稳定
2．本产品经鉴定检测敏感
使用承诺
上海极威生物科技有限公司秉着“信誉至上、客户满意、质量承诺”的宗旨为我们的用户提供优质产品和服务。用户收到货后，应按照产品说明书上的规定妥善保管并在有效期内使用。我们的产品在销售前已作严格的质量鉴定，保证说明书所述的使用效果。在货到后10天内若发现确属本产品的质量问题，请立即以书面形式（实验报告）与本公司联系，并将该产品退回，经检验确系产品质量所致，本公司负责更换产品。如系使用者错误操作所致，本公司不承担由此造成的损失。
友情提醒
IF IT DOESN’T WORK， RECHECK YOUR EXPERIMENT TO SEE WHAT YOU DID WRONG。
订购信息
编号 名称 规格
G&VS50140.1.3 细胞AMPK激酶活性比色法定量检测试剂盒 20次
G&VS50140.1.3A 清理液（Reagent A） 500毫升
G&VS50140.1.3B 裂解液（Reagent B） 100毫升
G&VS50140.1.3C 缓冲液（Reagent C） 50毫升
G&VS50140.1.3D 酶促液（Reagent D） 5毫升
G&VS50140.1.3E 反应液（Reagent E） 5毫升
G&VS50140.1.3F 底物液（Reagent F） 5毫升
G&VS50140.1.3G 阴性液（Reagent G） 5毫升
产品编号 名称 规格
G&VS50054.1 细胞Akt1/PKB激酶活性比色法定量检测试剂盒 20次
G&VS50054.2 组织Akt1/PKB激酶活性比色法定量检测试剂盒 20次
G&VS50054.3 细胞Akt2/PKBβ激酶活性比色法定量检测试剂盒 20次
G&VS50054.4 组织Akt2/PKBβ激酶活性比色法定量检测试剂盒 20次
G&VS50054.5 细胞Akt3/PKBγ激酶活性比色法定量检测试剂盒 20次
G&VS50054.6 组织Akt3/PKBγ激酶活性比色法定量检测试剂盒 20次
G&VS50056.1 细胞ERK1/2激酶活性比色法定量检测试剂盒 20次
G&VS50056.2 组织ERK1/2激酶活性比色法定量检测试剂盒 20次
G&VS50057.1 细胞P38激酶活性比色法定量检测试剂盒 20次
G&VS50057.2 组织P38激酶活性比色法定量检测试剂盒 20次
G&VS50058.1 细胞PI3K激酶活性比色法定量检测试剂盒 20次
G&VS50058.2 组织PI3K激酶活性比色法定量检测试剂盒 20次
G&VS50059.1 细胞PKA激酶活性比色法定量检测试剂盒 20次
G&VS50059.2 组织PKA激酶活性比色法定量检测试剂盒 20次
G&VS50060.1 细胞Src激酶活性比色法定量检测试剂盒 20次
G&VS50060.2 组织Src激酶活性比色法定量检测试剂盒 20次
G&VS50126.1 细胞PKC激酶活性比色法定量检测试剂盒 20次
G&VS50126.2 组织PKC激酶活性比色法定量检测试剂盒 20次
G&VS50140.1 细胞AMPK激酶活性比色法定量检测试剂盒 20次
G&VS50140.2 组织AMPK激酶活性比色法定量检测试剂盒 20次
G&VS50159.1 细胞ERK1激酶活性比色法定量检测试剂盒 20次
G&VS50159.2 组织ERK1激酶活性比色法定量检测试剂盒 20次
G&VS50159.3 细胞ERK2激酶活性比色法定量检测试剂盒 20次
G&VS50159.4 组织ERK2激酶活性比色法定量检测试剂盒 20次
G&VS50161.1 细胞GSK3α激酶活性比色法定量检测试剂盒 20次
G&VS50161.2 组织GSK3α激酶活性比色法定量检测试剂盒 20次
G&VS50161.3 细胞GSK3β激酶活性比色法定量检测试剂盒 20次
G&VS50161.4 组织GSK3β激酶活性比色法定量检测试剂盒 20次
G&VS50171.1 细胞P38β2激酶活性比色法定量检测试剂盒 20次
G&VS50171.2 组织P38β2激酶活性比色法定量检测试剂盒 20次
G&VS50178.1 细胞PKCα激酶活性比色法定量检测试剂盒 20次
G&VS50178.2 组织PKCα激酶活性比色法定量检测试剂盒 20次
G&VS50178.3 细胞PKCβ1激酶活性比色法定量检测试剂盒 20次
G&VS50178.4 组织PKCβ1激酶活性比色法定量检测试剂盒 20次
G&VS50178.5 细胞PKCβ2激酶活性比色法定量检测试剂盒 20次
G&VS50178.6 组织PKCβ2激酶活性比色法定量检测试剂盒 20次
G&VS50178.7 细胞PKCγ激酶活性比色法定量检测试剂盒 20次
G&VS50178.8 组织PKCγ激酶活性比色法定量检测试剂盒 20次
G&VS50178.9 细胞PKCδ激酶活性比色法定量检测试剂盒 20次
G&VS50178.10 组织PKCδ激酶活性比色法定量检测试剂盒 20次
G&VS50178.11 细胞PKCε激酶活性比色法定量检测试剂盒 20次
G&VS50178.12 组织PKCε激酶活性比色法定量检测试剂盒 20次
G&VS50178.13 细胞PKCζ激酶活性比色法定量检测试剂盒 20次
G&VS50178.14 组织PKCζ激酶活性比色法定量检测试剂盒 20次
G&VS50178.15 细胞PKCη激酶活性比色法定量检测试剂盒 20次
G&VS50178.16 组织PKCη激酶活性比色法定量检测试剂盒 20次
G&VS50178.17 细胞PKCθ激酶活性比色法定量检测试剂盒 20次
G&VS50178.18 组织PKCθ激酶活性比色法定量检测试剂盒 20次
G&VS50178.19 细胞PKCι激酶活性比色法定量检测试剂盒 20次
G&VS50178.20 组织PKCι激酶活性比色法定量检测试剂盒 20次
