乙醇脱氢酶（alcohol dehydrogenase，ADH）活性测定试剂盒说明书

紫外分光光度法

注意：正式测定之前选择 2-3 个预期差异大的样本做预测定。

测定意义：

ADH是生物体内短链醇代谢的关键酶，催化乙醇与乙醛可逆转换，在很多生理过程中起着重要作用。哺乳动物ADH主要在肝脏生成，肝脏损伤导致ADH释放到血清中。血清ADH活性高低反映了肝功能是否异常。

测定原理：

ADH催化NADH还原乙醛生成乙醇和NAD⁺，NADH 在340nm处有吸收峰，而NAD ⁺没有；测定340nm 吸光度下降速率，来计算ADH活性。

自备仪器和用品：

研钵、冰、低温离心机、紫外分光光度计、1mL 石英比色皿、可调式移液器和蒸馏水。

试剂组成和配制：

试剂一：液体×1 瓶，室温保存。

试剂二：液体×1 瓶，4℃保存。临用前把试剂三转移到试剂二中，4℃保存。

试剂三：粉剂×1 瓶，－20℃保存。

试剂四：液体×1 支，4℃保存。

粗酶液提取：

1、 组织：按照组织质量（g）：试剂一体积(mL)为 1：5~10 的比例（建议称取约 0.1g 组织，

加入 1mL 试剂一）进行冰浴匀浆。16000g，4℃离心 20min，取上清置冰上待测。

2、 细菌、真菌：按照细胞数量（10⁴个）：试剂一体积（mL）为500~1000：1 的比例（建议 500 万细胞加入1mL试剂一），冰浴超声波破碎细胞（功率300w，超声3秒，间隔7秒，总时间 3min）；16000g，4℃离心20min，取上清液置冰上待测。

3、血清等液体：直接测定。

ADH 测定操作：

1. 分光光度计预热30min，调节波长到340nm，蒸馏水调零。

2. 试剂二在25℃水浴中保温30min。

3. 空白管：在1mL石英比色皿中依次加入100μL 蒸馏水、800μL试剂二和100μL试剂四，

迅速混匀后于340nm测定吸 光值变化，分别记录15s和75s时吸光值，分别记为A1和A2。△A空白管=A1-A2。。

4. 测定管：在1mL石英比色皿中依次加入100μL上清液、800μL 试剂二和100μL试剂四，迅速混匀后于340nm 测定吸光值变化，分别记录 15s 和75s时吸光值，分别记为A3和A4。△A 测定管=A3-A4。

注意：空白管只需测定一次。

计算公式：

（1）按照蛋白浓度计算

活性单位定义：25℃中每毫克蛋白每分钟氧化 1μmol NADH 为 1 个酶活单位。

ADH (μmol/min/mg prot) =[(△A 测定管–△A空白管)÷ε÷d×V 反总×10⁶] ÷(Cpr×V 样)÷T=1.61×(△A 测定管–△A空白管) ÷Cpr

 

（2）按照样本质量计算

活性单位定义：25℃中每克组织每分钟氧化 1μmolNADH 为1个酶活单位。

ADH (μmol/min/g) =[(△A 测定管–△A空白管)÷ε÷d×V 反总×10⁶ ] ÷(W×V 样÷V 样总)÷T=1.61×(△A 测定管–△A空白管)÷W

（3）按细胞数量计算

活性单位定义：25℃中每10⁴个细胞每分钟氧化1μmolNADH 为1个酶活单位。

ADH (μmol/min/10⁴cell) = [(△A 测定管–△A 空白管)÷ε÷d×V 反总×10 6 ] ÷(细胞数量×V 样÷V样总)÷T=1.61×(△A 测定管–△A 空白管) ÷细胞数量

（4）按液体体积计算

活性单位定义：25℃中每毫升血清每分钟氧化 1μmol NADH 为 1 个酶活单位。

ADH (μmol/min/mL) = [(△A 测定管–△A 空白管)÷ε÷d×V 反总×10⁶] ÷V 样÷T

=1.61×(△A 测定管–△A 空白管)

 

ε：NADH 摩尔消光系数，6.22×10³ L/mol/cm；d：比色皿光径，1 cm；V 反总：反应体系总体积，1000μL=0.001 L；Cpr：上清液蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；V 样：加入反应体系中上清液体积，100μL=0.1 mL；T：反应时间，1min。

 

注意事项：

1. 上清液蛋白质浓度需要另外测定，建议使用本公司 BCA 蛋白质含量测定试剂盒。

2. 配制好的试剂二 3 天使用完。