丙酮酸脱羧酶（ pyruvate decarboxylase,PDC ）
活性测定试剂盒说明书
紫外分光光度法
注意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。
测定意义：
PDC主要存在于酵母中，是乙醇发酵的关键酶之一，催化丙酮酸脱羧生成乙醛。
测定原理：
PDC催化丙酮酸脱羧生成乙醛，添加乙醇脱氢酶（ADH）来进一步催化 NADH还原乙醛生
成乙醇和NAD+；NADH在340nm有吸收峰，而NAD+没有；通过测定340 nm光吸收下降速率，来计算PDC活性。
自备仪器和用品：
研钵、冰、台式离心机、紫外分光光度计、1mL 石英比色皿、可调式移液枪和蒸馏水。
试剂组成和配制：
试剂一：液体×1 瓶，4℃保存。
试剂二：液体×1 瓶，4℃保存。
试剂三：液体×1 瓶，4℃保存。
试剂四：粉剂×1 瓶，﹣20℃保存。
试剂五：液体×1 瓶，﹣20℃保存。
混合试剂：临用前配制，小心把试剂四和五转移到试剂三中，充分溶解。
试剂六：液体×1 瓶，4℃保存。
粗酶液提取：
1、细菌或细胞处理：收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照每200万细菌或细胞加入400μL试剂一，超声波破碎细菌或细胞（功率200W，工作3s，间歇10s，工作35次），16000g 4℃离心20min，取上清，置冰上待测。
2、组织处理：按照组织质量（g）：试剂一体积(mL)为 1：5~10 的比例（建议称取约 0.1g 组
织，加入 1mL 试剂一）进行冰浴匀浆，16000g 4℃离心 20min，取上清，置冰上待测。
3、血清（浆）等液体样品：直接检测。
PDC 测定操作：
1. 分光光度计预热30min，调节波长到340 nm，蒸馏水调零。
2. 试剂二置于25℃水浴中预热30min。
3. 空白管：依次在 1mL 石英比色皿中加入100μL蒸馏水、100μL混合试剂、700μL试剂二
和100μL试剂六，迅速混匀后于340nm比色，记录15s和75s的吸光值，分别记为 A1 和A2。
4. 测定管：依次在1mL石英比色皿中加入100μL上清液、100μL混合试剂、700μL试剂二
和100μL试剂六，迅速混匀后于340nm 比色，记录15s和75s的吸光值，分别记为A3和A4。
注意：空白管只需测定一次。
PDC 活性计算公式：
（1）按照蛋白浓度计算
活性单位定义：25℃中，每毫克蛋白每分钟催化 1μmol NADH 氧化为 1 个酶活单位。
PDC (μmol/min/mg prot) ={[(A3－A4)－(A1-A2)]÷ε÷d×V 总×106 }÷(Cpr×V 样) ÷T
=1.61×[(A3－A4)－(A1-A2)]÷Cpr
（2）按照样本质量计算
活性单位定义：25℃中，每克组织每分钟催化 1μmol NADH 氧化为 1 个酶活单位。
PDC (μmol/min/g) ={[(A3－A4)－(A1-A2)]÷ε÷d×V 总×106 }÷(W×V 样÷V 样总) ÷T
=1.61×[(A3－A4)－(A1-A2)]÷W
（3）按细胞数量计算
活性单位定义：25℃中，每104个细胞每分钟催化1μmol NADH 氧化为 1 个酶活单位。
PDC (μmol/min/104 cell) ={[(A3－A4)－(A1-A2)]÷ε÷d×V 总×106 }÷(细胞数量×V 样÷V 样总)÷T=1.61×[(A3－A4)－(A1-A2)]÷细胞数量
（4）按血清（浆）体积计算
活性单位定义：25℃中，每毫升血清（浆）每分钟催化1μmolNADH 氧化为1个酶活单位。
PDC (μmol/min /mL) ={[(A3－A4)－(A1-A2)]÷ε÷d×V 总×106 }÷V 样÷T
=1.61×[(A3－A4)－(A1-A2)]
ε：NADH 摩尔消光系数，6.22×10 3 L/mol/cm；d：比色皿光径，1cm；V 总：反应体系总体
积，1mL=0.001L，V 样：加入反应体系中上清液体积，0.1mL；Cpr：蛋白浓度（mg/mL），需要另外测定，建议使用本公司BCA蛋白质含量试剂盒；W：样本质量，g ；V 样总：加入提取液体积，1mL；T：反应时间，1 min。
注意事项：
配制好的混合液 3 天内使用完。
