NAD-苹果酸脱氢酶（NAD-MDH）试剂盒说明书
紫外分光光度法
产品内容：
试剂一、提取液60 mL×1瓶，在4℃保存；
试剂二、液体50 mL×1瓶，在4℃保存；
试剂三、粉剂×2支，-20℃保存；临用前加入300μL蒸馏水，用不完的试剂仍-20℃保存；
试剂四、粉剂×2支，-20℃保存；临用前加入300μL蒸馏水，用不完的试剂仍-20℃保存。
产品说明：
MDH（EC 1.1.1.37）广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，线粒体中MDH 是TCA循环的关键酶之一，催化苹果酸形成草酰乙酸；相反，胞浆中MDH 催化草酰乙酸形成苹果酸。草酰乙酸是重要的中间产物， 连接多条重要的代谢途径。因此，MDH 在细胞多种生理活动中扮演着重要的角色，包括线粒体的能量代谢、苹果酸-天冬氨酸穿梭系统、活性氧代谢和抗病性等。根据不同的辅酶特异性，MDH 分为NAD-依赖的MDH 和NADP-依赖的MDH，细菌中通常只含有NAD-MDH，在真核细胞中，NAD-MDH 分布于细胞质和线粒体中。
NAD-MDH 催化NADH 还原草酰乙酸生成苹果酸，导致340nm 处光吸收下降。
需自备的仪器和用品：
紫外分光光度计、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、1 mL石英比色皿和蒸馏水。
操作步骤：
一、样本测定的准备：
1、 细菌、细胞或组织样品的制备：
细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（104 个）：试剂一体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细菌或细胞加入1mL试剂一），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率20％或200W，超声3s，间隔10s，重复30 次）；8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。
组织：按照组织质量（g）：试剂一体积(mL)为1：5~10 的比例（建议称取约0.1g 组织，加入1mL 试剂一），进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。
2、 血清（浆）样品：直接检测。
二、测定步骤：
1、 分光光度计预热30min以上，调节波长至340nm，蒸馏水调零。
2、 将试剂二在37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种）水浴10min以上。
3、 操作表：
| 试剂名称（μL） | 测定孔 |
| 样本 | 20 |
| 试剂二 | 760 |
| 试剂三 | 10 |
| 试剂四 | 10 |
将上述试剂按顺序加入1 mL石英比色皿中，混匀后立即在340 nm 波长下记录初始吸光度A1 和反应1min后的吸光度A2，计算ΔA=A1-A2。
注意：若A1-A2 大于0.5，需将样本用提取液稀释，使A1-A2 小于0.5，可提高检测灵敏度。计算公式中乘以相应稀释倍数。
三、NAD-MDH 活力单位的计算：
1、 血清（浆）NAD-MDH 活力的计算
单位的定义：每毫升血清（浆）每分钟消耗1 nmol 的NADH 定义为一个酶活力单位。
NAD-MDH（U/mL）=[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109]÷V 样÷T=6430×ΔA
2、 组织、细菌或细胞中NAD-MDH 活力的计算:
（1） 按样本蛋白浓度计算：
单位的定义：每mg 组织蛋白每分钟消耗1 nmol 的NADH 定义为一个酶活力单位。
NAD-MDH（U/mg prot）=[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109]÷(V 样×Cpr) ÷T
=6430×ΔA÷Cpr
（2） 按样本鲜重计算：
单位的定义：每g 组织每分钟消耗1 nmol 的NADH 定义为一个酶活力单位。
NAD-MDH（U/g 鲜重）=[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109]÷（W× V 样÷V 样总）÷T
=6430×ΔA÷W
（3） 按细菌或细胞密度计算：
单位的定义：每1 万个细菌或细胞每分钟消耗1 nmol 的NADH 定义为一个酶活力单位。
NAD-MDH（U/104 cell）=[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109]÷（500×V 样÷V 样总）÷T
=12.86×ΔA
V 反总：反应体系总体积，8×10-4 L；ε：NADH 摩尔消光系数，6.22×103 L / mol /cm；d：比色皿光径，1cm；V 样：加入样本体积，0.02mL；V 样总：加入提取液体积，1 mL；T：反应时间，1 min；W：样本质量，g；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；500：细胞或细菌总数，500 万。
