完全线粒体内膜功能（膜电位）荧光测定试剂盒产品说明书

主要用途

完全线粒体内膜功能（膜电位）荧光测定试剂是一种旨在通过高度敏感的阳离子荧光羰花青染料结合到线粒体基质，其荧光的增强或减弱说明线粒体膜电位的变化，即内膜电负性的增高或降低，来分析线粒体内膜功能的完整性的权威而经典的技术方法。该技术由大师级科学家精心研制、成功实验证明的。其适用于各种纯化线粒体制备物和活体细胞线粒体的功能检测。可以被用于细胞凋亡、信号传递、衰老等的研究。产品严格无菌，即到即用，活体检测，操作极为简易，性能稳定。

技术背景

阳离子荧光羰花青染色剂JC-1（5,5',6,6'-tetrachloro-1,1',3,3'-tetraethylbenzimidazolcarbocyanine iodide）是一种对膜电位高度敏感的染色剂。它特异性地进入线粒体，分布和结合在线粒体基质上。线粒体膜电位的高低变化决定了JC-1的分布浓度。电位高，JC-1形成聚集体，而浓度高，荧光显色为红色或桔红色；反之，则为绿色。荧光减弱表明线粒体内膜功能受到损害。

产品内容

保存液（Reagent A）        毫升

染色液A（Reagent B）    微升

染色液B（Reagent C）    微升

稀释液（Reagent D）        毫升

清理液（Reagent E）        毫升

产品说明书          1份

保存方式

保存清理液（Reagent E）在4℃冰箱里，其余的保存在－20℃冰箱里；染色液A（Reagent B）和染色液B（Reagent C）避免光照；有效保证12月

用户自备

胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液（G&VS12024）：用于细胞脱离

 DMEM完全细胞培养液（G&VS12052）：用于细胞脱落收集

1.5毫升离心管：用于染色的容器

（微型）台式离心机：用于样品操作

培养箱：用于染色孵育

比色皿或96孔板：用于荧光定量分析的容器

（共聚焦）荧光显微镜：用于线粒体荧光定性分析

荧光分光光度仪或荧光酶标仪：用于荧光定量分析

细胞流式仪：用于线粒体荧光分析

实验步骤

A． 纯化线粒体检测

实验开始前，将－20℃冰箱里的试剂盒中的染色液A（Reagent B）置入冰槽里融化，稀释液（Reagent D）放进37℃恒温水槽里预热。然后移出xx微升染色液A（Reagent B）到新的1.5毫升离心管，加入xx微升稀释液（Reagent D），混匀后，在冰槽里静置，并标记为染色工作液，放在暗室里。然后进行下列操作。

一、 荧光显微镜检测

1． 从纯化的线粒体样品中移出至少含10⁷细胞中提取的线粒体到新的预冷的1.5毫升离心管，置入冰槽里

2． 加入适量的保存液（Reagent A）至最终容量为100微升（含有50微克线粒体蛋白质为理想状态）

3． 加入xx微升含有染色液A（Reagent B） 和稀释液（Reagent D）的染色工作液，轻柔混匀

4． 放进暗室里，在室温下孵育10分钟（注意：检测前置于冰槽里）

5． 即刻移入到载玻片上在荧光显微镜下进行观察（单滤波或双滤波）：

二、 荧光酶标仪检测

1． 分别加入xx微升含有染色液A（Reagent B）和稀释液（Reagent D）的染色工作液到96孔板的每个孔里

2． 加入10微升纯化的线粒体样品（含有5微克线粒体蛋白质为理想状态）

3． 轻轻摇匀96孔板

4． 放进暗室里，在室温下孵育10分钟（注意：检测前置于冰槽里）

5． 即刻放进荧光分光光度仪测定（单一测定或双重测定）： 

 

三、荧光分光光度仪检测

1. 从纯化的线粒体样品中移出至少含10⁷细胞中提取的线粒体到新的预冷的1.5毫升离心管，置入冰槽里

2. 加入适量的保存液（Reagent A）至最终容量为100微升（含有50微克线粒体蛋白质为理想状态）

3. 加入xx微升含有染色液A（Reagent B）和稀释液（Reagent D）的染色工作液到1毫升比色皿里（注意：若使用2毫升比色皿，用量相应加倍）

4. 加入100微升纯化的线粒体样品

5. 上下倾倒比色皿，轻轻混匀

6. 放进暗室里，在室温下孵育10分钟（注意：检测前置于冰槽里）

7. 即刻放进荧光分光光度仪测定（单一测定或双重测定）： 

B． 活体细胞检测

实验开始前，将－20℃冰箱里的试剂盒中的染色液B（Reagent C）置入冰槽里融化，稀释液（Reagent D）放进37℃恒温水槽里预热。然后移出xx微升染色液B（Reagent C）到新的1.5毫升离心管，加入xx微升稀释液（Reagent D），混匀后，在冰槽里静置，并标记为染色工作液，放在暗室里。然后进行下列操作。

一、直接法

1． 准备1个12孔细胞培养板的待测细胞，每孔铺满率达70％（约30万细胞数）

2． 小心抽去细胞培养液

3． 轻轻沿着孔壁加入xx毫升 清理液（Reagent E）到细胞培养孔，覆盖培养孔表面

4． 小心抽去xx毫升 清理液（Reagent E） 

5． 加入xx微升含有染色液B（Reagent C）和稀释液（Reagent D）的染色工作液， 覆盖培养孔表面

6． 放进37℃细胞培养箱里，孵育20分钟（注意：避光操作）

7． 小心抽去xx微升染色工作液

8． 小心加入xx微升清理液（Reagent E）（注意：检测前置于冰槽里）

9． 即刻在倒置荧光显微镜下进行观察（单滤波或双滤波）：

二、 间接法

1． 准备1个12孔细胞培养板的待测细胞，每孔铺满率达70％（约30万细胞数）

2． 小心移出细胞培养液到15毫升锥形离心管（收集悬浮细胞）

3． 加入xx毫升 清理液（Reagent E）到细胞培养孔，覆盖培养孔表面

4． 小心移出xx毫升 清理液（Reagent E）到15毫升锥形离心管（收集洗脱细胞）

5． 加入500微升用户自备的胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液，铺满整个培养孔表面

6． 置入37℃培养箱1分种

7． 轻轻手击震动培养板，使细胞脱落

8． 加入1毫升用户自备的完全细胞培养液

9． 移入15毫升锥形离心管

10． 放进台式离心机离心5分钟，速度为300g

11． 小心抽去上清液

12． 加入xx微升清理液（Reagent E）

13． 用200微升枪头上下轻柔抽吸，混匀细胞颗粒群

14． 转入到1.5毫升离心管或细胞流式仪专用测试管

15． 加入xx微升含有染色液B（Reagent C）和稀释液（Reagent D）的染色工作液

16． 轻度涡旋震荡2秒

17． 放进37℃细胞培养箱里，孵育20分钟（注意：避光操作）

18． 放进微型台式离心机离心5分钟，速度为300g

19． 小心抽去上清液

20． 加入xx微升清理液（Reagent E）（注意：检测前置于冰槽里）

选择一、荧光显微镜观察 

1. 混匀后，移出50微升在载玻片上

2. 即刻进行载玻片压片，在荧光显微镜下进行观察（单滤波或双滤波）：

选择二、细胞流式仪分析

1． 混匀后，即刻进行细胞流式仪双通道分析：观察50000个细胞以上

激发波长	488nm	488nm
匹配荧光染料	异硫氰酸荧光素（FITC）	藻红蛋白（phycoerythrin；PE）
荧光颜色	绿色	红色
散发波长	530	575
流式仪通道	FL1	FL2
荧光增强	膜损伤	膜电位正常

选择三、荧光分光光度仪或荧光酶标仪测定

1. 混匀后，移出100微升到黑色96孔板里或100微升比色皿里

2. 即刻进行荧光分光光度仪96孔酶标仪或比色皿测定（单一测定或双重测定）：

注意事项

1． 本产品为5次（900微升纯化线粒体染色工作液）、10次（450微升细胞染色工作液）20次（200微升细胞染色工作液）和50次（100微升纯化线粒体染色工作液）操作

2． 操作时，须戴手套

3． 待测细胞建议不要过于饥饿或过度生长

4． 建议细胞染色完成后，即刻进行荧光检测分析

5． 根据细胞类型，可以适当稀释1至10倍染色液浓度

6． 孵育时，必须避免光照

7． 纯化线粒体检测建议采用红色单滤波或单一测定则可

8． 活体细胞检测建议采用双滤波或双重测定：健康细胞和线粒体呈现红色；死亡或凋亡细胞及损伤线粒体呈现绿色

9． 本公司提供缬氨霉素溶液（G&VS12042），作为线粒体内膜破坏分子，观察荧光显著减弱现象

10． 细胞流式仪检测参考图像如下

（A）正常膜电位：

 

（B）损伤膜电位：

 

11． 本公司提供系列线粒体分析试剂产品

质量标准

1． 本产品经鉴定性能稳定

2． 本产品经鉴定荧光清晰

使用承诺

上海极威生物科技有限公司秉着“信誉至上、客户满意、质量承诺”的宗旨为我们的用户提供优质产品和服务。用户收到货后，应按照产品说明书上的规定妥善保管并在有效期内使用。我们的产品在销售前已作严格的质量鉴定，保证说明书所述的使用效果。在货到后10天内若发现确属本产品的质量问题，请立即以书面形式（实验报告）与本公司联系，并将该产品退回，经检验确系产品质量所致，本公司负责更换产品。如系使用者错误操作所致，本公司不承担由此造成的损失。

友情提醒

IF IT DOESN’T WORK， RECHECK YOUR EXPERIMENT TO SEE WHAT YOU DID WRONG。

订购信息

编号                   名称             规格

G&VS10013.3   完全线粒体内膜功能（膜电位）荧光测定试剂盒         50次

G&VS10013.3A  保存液（Reagent A）                毫升

G&VS10013.3B   染色液A（Reagent B）                微升

G&VS10013.3C   染色液B（Reagent C）                微升

G&VS10013.3D   稀释液（Reagent D）                  毫升

G&VS10013.3E  清理液（Reagent E）                 毫升

G&VS12042    缬氨霉素溶液（0.1毫摩尔 ）              毫升

G&VS12024    胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液          毫升

G&VS12052    DMEM完全细胞培养液              毫升

产品编号	名称	规格
G&VS10006.1	动物细胞/组织线粒体粗提分离试剂盒	10/50次
G&VS10006.2	动物细胞/组织活性线粒体分离试剂盒	10/50次
G&VS10006.3	动物细胞/组织高质纯化线粒体分离试剂盒	10次
G&VS10013.1	纯化线粒体内膜功能/膜电位测定试剂盒	100次
G&VS10013.2	活体细胞线粒体内膜功能/膜电位测定试剂盒	20次
G&VS10013.3	完全线粒体内膜功能/膜电位测定试剂盒	20次
G&VS10013.4	活体组织线粒体内膜功能/膜电位测定试剂盒	10次
G&VS10013.5	真菌/酵母细胞线粒体内膜功能/膜电位测定试剂盒	20次
G&VS10014.1	线粒体外膜功能检测试剂盒	20次
G&VS10014.2	纯化线粒体细胞色素C氧化酶活性测定试剂盒	20次
G&VS10014.3	细胞/组织悬液细胞色素C氧化酶活性测定试剂盒	20次
G&VS10014.4	纯化细胞色素C氧化酶活性测定试剂盒	20次
G&VS10014.5	真菌/酵母细胞悬液细胞色素C氧化酶活性测定试剂盒	20次
G&VS10014.6	植物细胞色素C氧化酶活性测定试剂盒	20次
G&VS10015	线粒体功能詹纳斯绿B（JGB）染色试剂盒	20次
G&VS10019.1	活体细胞线粒体形态/活性荧光染色试剂盒	100/200次
G&VS10019.2	植物组织线粒体形态/活性荧光染色试剂盒	20次
G&VS10019.3	真菌/酵母细胞线粒体形态/活性荧光染色试剂盒	100次
G&VS10019.4	纯化线粒体形态/活性荧光染色试剂盒	100次