真菌/酵母细胞色素C氧化酶活性测定试剂盒产品说明书
主要用途
真菌/酵母细胞色素C氧化酶活性测定试剂是一种旨在通过细胞色素C氧化酶反应系统中还原性细胞色素C氧化后吸光峰值的降低,即采用比色法测定样品中酶活性的权威而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。其适用于各种真菌或酵母细胞株裂解悬液中细胞色素C氧化酶的活性检测。产品严格无菌,即到即用,操作简捷,性能稳定。
技术背景
细胞色素C氧化酶(Cytochrome c oxidase)存在于真核生物的细胞线粒体上(包括真菌和酵母细胞),主要通过氧化磷酸化为细胞提供能量。基于底物还原型细胞色素C(reduced cytochrome c),受到细胞色素C氧化酶的催化,转化为氧化型细胞色素C(oxidized cytochrome c),在分光光度仪下,出现吸光值的变化(550nm 波长),由此定量测定细胞色素C氧化酶的活性。细胞色素C氧化酶反应系统为:
产品内容
裂解液(Reagent A) 毫升
强化液(Reagent B) 毫升
活性液(Reagent C) 微升
缓冲液(Reagent D) 毫升
反应液(Reagent E) 毫升
稳定液A(Reagent F1)管
稳定液B(Reagent F2)微升
产品说明书1份
保存方式
强化液(Reagent B)和缓冲液(Reagent D)保存在4℃冰箱里,其余的保存在-20℃冰箱里;反应液(Reagent E)避免光照;有效保证6月
用户自备
15毫升锥形离心管:用于真菌/酵母细胞收集的容器
1.5毫升离心管:用于真菌/酵母细胞裂解操作或反应液配制的容器
台式离心机:用于沉淀真菌/酵母细胞
微型台式离心机:用于真菌/酵母细胞裂解悬液澄清
比色皿:用于比色检测的容器
分光光度仪:用于比色分析
实验步骤
一、 样品准备
1. 准备好10毫升待测的新鲜真菌/酵母细胞(OD600=0.4至0.8,即1至2 X 107细胞/毫升)
2. 移入到预冷的15毫升锥形离心管
3. 置于冰槽里5分钟
4. 放进4℃台式离心机离心5分钟,速度为1000g
5. 小心抽去上清液
6. 加入xx微升裂解液(Reagent A),充分混匀
7. 转移到预冷的1.5毫升离心管
8. 加入xx微升强化液(Reagent B)(注意:参见注意事项3)
9. 加入xx12.5微升活性液(Reagent C)
10. 强力涡旋震荡15秒
11. 置于冰槽里1分钟
12. 重复实验步骤10至11五次
13. 加入xx微升裂解液(Reagent A),充分混匀
14. 放进4℃微型台式离心机离心15分钟,速度为16000g(或13000RPM,例如eppendorf 5415)
15. 小心移取500微升上清液到新的预冷的1.5毫升离心管
16. 移取5微升进行蛋白定量测定(注意:建议使用 Bradford蛋白质浓度定量试剂盒-G&VS30030.1)
17. 即刻放进-70℃保存或置于冰槽里继续后续操作
二、 测读准备
1. 准备好上述制备好的样品,置于冰槽里融化
2. 设定好分光光度仪:温度28℃,波长550nm,间隔10秒,测读7次(共60秒),并置零或设置0秒和60秒各测读1次
3. 实验开始前,将-20℃冰箱里的试剂盒中的稳定液B(Reagent F2)置入冰槽里融化,然后移出xx微升到稳定液A(Reagent F1)管里,混匀后,标记为稳定工作液,置于冰槽里备用(注意,用完后即刻放回-20℃冰箱里)。然后将-20℃冰箱里的试剂盒中的反应液(Reagent E)置入冰槽里融化,然后移出100微升到新的1.5毫升离心管,加入xx微升稳定工作液,轻柔混匀后,室温下暗室里静置至少15分钟(可见颜色变化),置于冰槽里,标记为反应工作液(注意:参见注意事项6),放在暗室里
4. 缓冲液(Reagent D)室温下均衡温度
三、 背景对照测定
1. 移取xx微升缓冲液(Reagent D)到新的1毫升比色皿
2. 加入xx微升裂解液(Reagent B)
3. 上下倾倒数次,混匀
4. 室温下孵育2分钟
5. 放进分光光度仪,置零
6. 取出比色皿,加入xx微升含有反应液(Reagent E)和稳定液(Reagent F)的反应工作液
7. 上下倾倒数次,混匀
8. 即刻放进分光光度仪检测,此为背景空对照(0秒读数-60秒读数),正常读数差值为0.001至0.005
四、 样品测定
1. 移取xx微升缓冲液(Reagent D)到新的比色皿
2. 加入100微升待测样品(注意:建议总量50微克总蛋白,且样品需澄清)
3. 上下倾倒数次,混匀
4. 室温下孵育2分钟
5. 放进分光光度仪,置零
6. 取出比色皿,加入xx微升含有反应液(Reagent E)和稳定液(Reagent F)的反应工作液
7. 即刻上下倾倒数次,混匀(限定在3秒之内)
8. 即刻放进分光光度仪检测,此为样品读数(0秒读数-60秒读数),通常活性读数差值为正数
四、 计算样品活性
注意事项
1. 本产品为20次操作,包括背景对照
2. 操作时,须戴手套
3. 样品中忌用DTT和巯基乙醇等处理
4. 强化液(Reagent B)为固体状,移取方法为:使用1毫升枪头,将尖端部分剪去;或使用0.5毫升PCR管的盖子内圈盛满;或秤重0.1克
5. 建议测定细胞裂解悬液的蛋白浓度,便于计算活性单位之需;建议使用 Bradford蛋白质浓度定量检测试剂盒(G&VS30030.1)
6. 每增加1个样品,增加反应工作液为:反应液(Reagent E)50微升+稳定工作液1.5微升,以此类推。配制反应工作液时,须根据样本数量配制实际工作液容量
7. 系统操作过程中,背景测定只需1次
8. 分光光度计波长严格设置在550nm,误差10nm将不产生信号
9. 加样后3秒内进行比色测定
10. 比色测定后,比色皿须清洗彻底
11. 背景空对照0秒读数通常0.2至0.8为理想状态
12. 背景空对照的正常读数差值(0秒-60秒)通常为0.001至0.005(正负即可)
13. 样品0秒读数通常和背景空对照0秒读数一致
14. 样本测定60秒读数低于0秒读数表明具有酶活性
15. 酶活性单位浓度定义:在28℃室温下,pH 7.0的情况下,每单位酶在单位时间内(每分钟)氧化1微摩尔的细胞色素C
16. 建议待测样本总蛋白浓度为50微克/100微升;如果样本酶活性过低或过高,即60秒读数不变或为零,则可以增加或降低样本量(本公司提供 Bradford蛋白质浓度定量试剂盒G&VS30030.1)
17. 本公司提供系列细胞色素相关试剂产品
质量标准
1. 本产品经鉴定性能稳定
2. 本产品经鉴定检测敏感
使用承诺
上海极威生物科技有限公司秉着“信誉至上、客户满意、质量承诺”的宗旨为我们的用户提供优质产品和服务。用户收到货后,应按照产品说明书上的规定妥善保管并在有效期内使用。我们的产品在销售前已作严格的质量鉴定,保证说明书所述的使用效果。在货到后10天内若发现确属本产品的质量问题,请立即以书面形式(实验报告)与本公司联系,并将该产品退回,经检验确系产品质量所致,本公司负责更换产品。如系使用者错误操作所致,本公司不承担由此造成的损失。
友情提醒
IF IT DOESN’T WORK, RECHECK YOUR EXPERIMENT TO SEE WHAT YOU DID WRONG。
订购信息
单组分订购信息
编号 名称 规格
G&VS10014.5 真菌/酵母细胞色素C氧化酶活性测定试剂盒 20次
G&VS10014.5A 裂解液(Reagent A) 毫升
G&VS10014.5B 强化液(Reagent B) 毫升
G&VS10014.5C 活性液(Reagent C) 毫升
G&VS10014.5D 缓冲液(Reagent D) 毫升
G&VS10014.5E 反应液(Reagent E) 毫升
G&VS10014.5F 稳定液A(Reagent F1) 管
G&VS10014.5G 稳定液B(Reagent F2) 毫升
G&VS30030.1 Bradford蛋白质浓度定量试剂盒 100次
试剂盒订购信息
产品编号 | 名称 | 规格 |
G&VS10014.1 | 线粒体外膜功能检测试剂盒 | 20次 |
G&VS10014.2 | 纯化线粒体细胞色素C氧化酶活性测定试剂盒 | 20次 |
G&VS10014.3.1 | 细胞细胞细胞色素C氧化酶活性测定试剂盒 | 20次 |
G&VS10014.3.2 | 组织样品细胞色素C氧化酶活性测定试剂盒 | 20次 |
G&VS10014.4 | 纯化细胞色素C氧化酶活性测定试剂盒 | 20次 |
G&VS10014.5 | 真菌/酵母细胞色素C氧化酶活性测定试剂盒 | 20次 |
G&VS10014.6 | 植物细胞色素C氧化酶活性测定试剂盒 | 20次 |