CAT#:JW-15-41000
低温运输，-20℃保存

产品及特点
恙虫病东方体（Orientia tsutsugamsushi）属立克次体科东方体属，为革兰阴性专性胞内寄生的杆菌。恙虫病东方体是恙虫病的病原体，该病主要通过恙螨幼虫叮咬而传播，是一种自然疫源性疾病，是由恙虫病东方体引起的一种未分化的急性发热性疾病，是一种复发性感染。对于恙虫病病人来说，它是一种抗生素可治愈的疾病，但是容易误诊，如不加适当的治疗，病死率可达30%~50%，给人类健康造成极大危害。因此恙虫病东方体的快速检测具有重要意义，为此本公司以探针法qPCR技术为基础开发了恙虫病东方体的检测试剂盒，它具有下列特点：
1.即开即用，用户只需要提供样品DNA模板。
2.引物和探针经过优化，灵敏度高，最低检测限可达100拷贝/反应。
3.提供阳性对照，便于区分假阴性样品。
4.特异性高，引物是根据恙虫病东方体基因组DNA高度保守区设计，不会跟其它生物的DNA发生交叉反应。
5.既可用于定性检测，又可用于定量检测。用于定量检测时，线性范围至少5个数量级。
6.本产品足够50次20 μL体系的探针法荧光定量PCR反应。
7.本产品只能用于科研。
规格及成分
本产品使用五孔盒包装
成分            编号        规格    包装
2×Probe qPCR MasterMix    981201        500 μL    0.5 mL本色盖
荧光PCR专用模板稀释液    180701        1 mL    1.5 mL绿盖管
超纯水            210806        1 mL    1.5mL蓝盖管
恙虫病东方体qPCR
引物-探针干粉        yp15-41000    50 次    0.5 mL棕色管
恙虫病东方体阳性对照
(1E7拷贝/μL)        pc41000-HQ660204    50 μL    0.5 mL黄盖管
使用手册            sc15-41000    1 份    1 份
注意：引物-探针干粉在使用前需要离心，然后在离心管中加入165 mL的超纯水充分混匀后再使用，未用完的需要-20℃保存。

运输及保存
低温运输，-20℃保存，保存期限为24个月。

自备物品
超纯水，样品DNA。
使用方法

一、稀释标准曲线样品（以1E1-1E6拷贝/μL这6个10倍稀释度为例）。
由于标准品浓度非常高，因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行，千万不能
污染样品或本试剂盒的其他成分。本产品不提供活体样品做阳性对照，只提供DNA片段作为阳性对照。
1.标记6个离心管，分别为6，5，4，3，2，1。
2.用带芯枪头分别加入45 μL荧光PCR专用模板稀释液，最好用带芯枪头（下同）。
3.在6号管中加入5 μL 1E7拷贝/μL的阳性对照(试剂盒提供)，充分震荡混匀1分钟，得到1E6拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。
4.换枪头，在5号管中加入5 μL 1E6拷贝/μL的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡混匀1分钟，得到1E5拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。
5.换枪头，在4号管中加入5 μL 1E5拷贝/μL的阳性对照(上步所得)，充分震荡混匀1分钟，得到1E4拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。
6.依次重复上面的操作得到6个稀释度的标准曲线样品。放冰上待用。

二、样品DNA的制备
7.如果有N个样品，最好设置N+2个提取，多出的一个是PC（样品制备阳性对照），一个是NC（样品制备阴性对照）。可以用10 μL上步所得4号稀释液再加上一定量的水使总体积跟每次制备要求的体积一样，以此作为PC。另外用水作为NC。
8.用自选方法纯化样品的DNA，本试剂盒跟市场上大多数样品DNA提取试剂盒兼容。也可以选购本公司的免提取核酸释放剂。

三、qPCR 反应（20 μL体系，在样品制备室进行）
9.如果做定量分析并且只做1次重复，则标记N+9个PCR管，其中N+2个用于上步得到的N+2个样品，1个用于PCR阴性对照（用水做模板），6个用于标准曲线。如果做定性分析并且只做1次重复，则标记N+4个PCR管，其中N+2个用于上步得到的N+2个样品，1个用于PCR阴性对照（用水做模板），1个用于PCR阳性对照（直接用第6步第4号管的阳性对照稀释液做模板）。下面只以定量分析为例描述操作步骤。
10.在标记管中按下表加入各成分（本表只列出一次重复。样品管和阴性对照设
置完毕后才设置阳性对照，并且阳性对照样品要等所有管子盖上盖子储存好后最后加）：
成分                                                样品管N+3个    PCR阴性对照管    标曲样品管（1-6）
2×Probe qPCR
MasterMix                                              各10 μL        10 μL               各10 μL
恙虫病东方体qPCR
引物-探针混合液                                      各3 μL        3 μL                各3 μL
待测样本DNA模板                                       7 μL        不加                不加
超纯水                                                          不加        7 μL                不加
第6步所得标准曲线样品稀释液（1-6号）    不加        不加                各7 μL（1号样到1号管，2号样到2号管…）
11.盖上盖子后上机，按下面参数进行PCR：
过程                温度    时间
预变性             95℃    5 min
PCR反应
（45个循环）   95℃    30 sec
                        55℃    30 sec
                       72℃    30 sec
（采集FAM通道，淬灭基团为BHQ）

四、数据处理
12.如果扩增阳性对照或制备阳性对照结果为阴性，则整个扩增或制备实验无效，不需要分析数据，需要重做扩增或制备或跟厂家联系。如果扩增阴性对照或制备阴性对照结果为阳性，说明环境污染，则整个扩增或制备实验无效，不需要分析数据，需要跟厂家联系，购买新的引物和探针。
13.如果阴性对照和阳性对照正常，则实验有效，可以进入后续分析。
14.如果把本试剂盒用于定量检测，则以阳性对照浓度的log值为横轴，以Ct值为纵轴，绘制标准曲线。再以待测样品的Ct值从标准曲线上推算出样品DNA浓度的log值，再推算出其浓度。
15.如果把本试剂盒用于定性检测，只判断阳性或阴性，则阴性对照必须无Ct或Ct大于或等于45。阳性对照必须有荧光对数增长，有典型扩增曲线，Ct值应该小于45，否则实验无效。如果实验有效，则分析待测样品，如果无Ct或Ct大于或等于45，则为阴性。如果Ct小于45则为阳性。

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