CAT#:JW-15-41500
低温运输，-20℃保存

产品及特点
猪流行性腹泻病毒（PEDV）是单股RNA，临床症状主要为水样腹泻，或腹泻之间有呕吐。病猪开始体温升高或仍正常，精神沉郁，食欲减退，继而排水样便，呈灰黄色或灰色吃食或吮乳后部分仔猪发生呕吐。日龄越小，病状越严重，1周龄以内的仔猪常于腹泻2～4天后，因脱水而死亡，病死率先50%。出生后立即感染本病时，病死率更高，可达100%。断奶猪、肥育猪及母猪持续腹泻4～7天，逐渐恢复正常。成年猪仅发生呕吐和厌食。因此检测猪流行性腹泻病毒有重要的意义。本产品就是以探针法qRT-PCR技术为基础开发的专门检测猪流行性腹泻病毒RNA的试剂盒，它具有下列特点：
1.即开即用，用户只需要提供样品RNA模板。
2.引物和探针经过优化，分析灵敏性高，可以达到100拷贝/反应。
3.提供阳性对照，便于区分假阴性样品。
4.特异性高，引物是根据猪流行性腹泻病毒RNA高度保守区设计，不会跟其他生物的RNA发生交叉反应。
5.既可用于定性检测，又可用于定量检测。用于定量检测时线性范围至少为5各数量级。
6.本产品足够50次20μL体系的探针法qRT-PCR反应。
7.本产品只能用于科研。

规格及成分
本产品采用五孔盒包装
成分                                                                                编号                        规格             包装
探针法qRT-PCR缓冲液                                                   990504a                 500 μL        0.5mL蓝盖管
探针法qRT-PCR酶混合液v2                                            990504bv2               50 μL        0.5mL红盖管
荧光PCR模板专用稀释液                                                180701                     1 mL       1.5 mL绿盖管
猪流行性腹泻病毒qRT-PCR
引物-探针干粉                                                                   yp15-41500zz         50次       1.5mL棕色管
猪流行性腹泻病毒qRT-PCR阳性对照(1×10E7拷贝/μL)    pcs61243-41500      50 μL        0.5mL黄盖管
使用手册                                                                            15-41500sc            1份                    无
注意：引物-探针干粉在使用前需要短暂离心，然后在离心管中加入162uL的超纯水充分混匀后再使用，未用完的需要-20℃保存。

运输及保存
低温运输，-20℃保存，保存期限为24个月。

自备试剂
样品RNA。

使用方法
一、稀释标准曲线样品（以10E1-10E6拷贝/μL这6个10倍稀释度为例）。由于标准品浓度非常高，因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行，千万不能污染样品或本试剂盒的其他成分）。为增加产品稳定性和避免扩散传染性病原，本产品不提供活体样品做阳性对照，只提供无传染性的DNA片段作为阳性对照。如果需要RNA阳性样品，需要另外订购。
1.标记6个离心管，分别为6，5，4，3，2，1。
2.用带芯枪头分别加入45 μL荧光PCR专用模板稀释液，最好用带芯枪头，下同）。
3.在6号管中加入5 μL 1×10E7拷贝/μL 的阳性对照(试剂盒提供)，充分震荡1分钟，得1×10E6拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。
4.换枪头，在5号管中加入5 μL 1×10E6拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡1分钟，得1×10E5拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。
5.换枪头，在4号管中加入5 μL 1×10E5拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡1分钟，得1×10E4拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。
6.重复上面的操作直到得到6个稀释度的标准曲线样品。放冰上待用。

二、样品RNA的制备
7.如果有N个样品，最好设置N+2个提取，多出的一个是PC（样品制备阳性对照），一个是NC（样品制备阴性对照）。可以用10μL上步所得4号稀释液再加上一定量的水使总体积跟每次样本制备所要求的起始样本体积一样，以此作为PC。另外用水作为NC。
8.用自选方法纯化样品的RNA，本试剂盒跟市场上大多数RNA提取试剂盒兼容，也可以选购本公司的免提取核酸释放剂。

三、Probe qRT-PCR反应（20μL体系，在样品制备室进行）
9.如果做定量分析并且只做1次重复，则标记N+9个RT-PCR管，其中N+2个用于上步得到的N+2个样品，1个用于RT-PCR阴性对照（用水做模板），6个用于标准曲线。如果做定性分析并且只做1次重复，则标记N+4个RT-PCR管，其中N+2个用于上步得到的N+2个样品，1个用于RT-PCR阴性对照（用水做模板），1个用于RT-PCR阳性对照（直接用第6步第4号管的阳性对照稀释液做模板）。下面只以定量分析为例描述操作步骤。
10.在标记管中按下表加入各成分（本表只列出一次重复。样品管和阴性对照设置完毕后才设置阳性对照，并且阳性对照样品要等所有管子盖上盖子储存好后最后加）：
成分                                                样品管N+2个     RT-PCR阴性对照       标准曲线样品管（1-6管）
探针法qRT-PCR缓冲液                       各10 μL        10 μL                      各10 μL
探针法qRT-PCR酶混合液v2                各1μL               1 μL                       各1 μL
猪流行性腹泻病毒qRT-PCR
引物-探针混合液                                   各3 μL               3 μL                      各3 μL
 N+2个待测RNA样本                            各6 μL               不加                      不加
超纯水                                                  不加                6 μL                                不加
第6步所得标准曲线样品稀释液（1-6号）    不加        不加        各6μL（2号样到2号管，3号样到3号管…）
11.盖上盖子后上机，按下面参数进行RT-PCR：
过程                   温度    时间
逆转录               50℃    10 min
预变性               95℃    10 min
PCR反应
（40个循环）    95℃     10 sec
                          55℃     10 sec（采集FAM通道的荧光信号，淬灭基团为TAMRA）

四、数据处理
12.如果样本制备阳性对照或PCR阳性对照(包括标曲样本)结果为阴性，则整个实验无效，不需要分析数据，需要重新样本制备，重新进行PCR扩增或跟厂家联系。如果样本制备阴性对照或PCR阴性对照结果为阳性，说明环境污染，则整个实验无效，不需要分析数据，需要跟厂家联系。
13.如果阴性对照和阳性对照均正常，则实验有效，可以进入后续分析。
14.如果把本试剂盒用于定量检测，则以阳性对照浓度的log值为横轴，以Ct值为纵轴，绘制标准曲线。再以待测样品的Ct值从标准曲线上推算出样品DNA浓度的log值，再推算出其浓度。
15.如果把本试剂盒用于定性检测，只判断阳性或阴性，则阴性对照必须无Ct或Ct大于或等于40。阳性对照必须有荧光对数增长，有典型扩增曲线，Ct值应该小于40，否则实验无效。如果实验有效，则分析待测样品，如果无Ct或Ct大于或等于40，则为阴性。如果Ct小于40则为阳性。

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