CAT#:JW-15-42500
低温运输，-20℃保存

产品及特点
猪圆环病毒（Porcine Circovirus，PCV）有PCV-1和PCV-2两种型，其基因组为单链DNA，长度分别为1759nt和1768nt，其同源性低于80%，但基因组结构相似。PCV-1无致病性，广泛存在于猪体内。PCV-2对猪具有较强的易感性，感染猪可自鼻液、粪便等废物中排出病毒，经口腔、呼吸道途径感染不同年龄的猪。感染病毒后的病猪最常见的症状是猪只渐进性消瘦或生长迟缓，这也是诊断所必需的临床依据，其他症状有厌食、精神沉郁、行动迟缓、皮肤苍白、被毛蓬乱、呼吸困难，咳嗽为特征的呼吸障碍，较少发现的症状为腹泻和中枢神经系统紊乱，一旦感染该病毒，发病率一般很低而病死率都很高，对养猪业带来较大的经济损失。本产品就是以探针法荧光定量PCR技术为基础开发，专门检测猪圆环病毒的试剂盒，它具有下列特点：
1.即开即用，用户只需要提供样品DNA模板。
2.引物和探针经过优化，分析灵敏性高，可以达到100拷贝/反应。
3.提供阳性对照，便于区分假阴性样品。
4.特异性高，引物是根据猪圆环病毒DNA高度保守区设计，不会跟其他的DNA发生交叉反应。
5.既可用于定性检测，又可用于定量检测。用于定量检测时线性范围至少为5个数量级。
6.本产品足够50次20μL体系的探针法荧光定量PCR反应。
7.本产品只能用于科研。
成分                                                                    编号            规格         包装材料
2×Probe qPCR MasterMix                                 981201        0.5 mL    0.5mL本色管
荧光PCR专用模板稀释液                                   180701        1 mL       1.5mL绿盖管
超纯水                                                                 210806        1 mL       1.5mL蓝盖管
猪圆环病毒qPCR
引物-探针干粉                                                    yp15-42500    50次    1.5mL棕色管
猪圆环病毒qPCR阳性对照(1×10E7拷贝/μL)      pc42500         50μL    0.5mL黄盖管
使用手册                                                             15-42500sc     1份    无

规格及成分
本产品采用5孔盒包装
注意：引物-探针干粉在使用前需要短暂离心，然后在离心管中加入162uL的超纯水充分混匀后再使用，未用完的需要-20℃保存。

运输及保存
低温运输，-20℃保存，保存期限为24个月。

自备试剂
样品DNA。

使用方法
一、稀释标准曲线样品（以10E1-10E6拷贝/μL这6个10倍稀释度为例）。由于标准品浓度非常高，因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行，千万不能污染样品或本试剂盒的其他成分）。为增加产品稳定性和避免扩散传染性病原，本产品不提供活体样品做阳性对照，只提供无传染性的DNA片段作为阳性对照。
1.标记6个离心管，分别为6，5，4，3，2，1。
2.用带芯枪头分别加入45μL荧光PCR专用模板稀释液，最好用带芯枪头，下同）。
3.在6号管中加入5μL 1×10E7拷贝/μL 的阳性对照(试剂盒提供)，充分震荡1分钟，得1×10E6拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。
4.换枪头，在5号管中加入5μL 1×10E6拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡1分钟，得1×10E5拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。
5.换枪头，在4号管中加入5μL 1×10E5拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡1分钟，得1×10E4拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。
6.重复上面的操作直到得到6个稀释度的标准曲线样品。放冰上待用。
二、样品DNA的制备
7.如果有N个样品，最好设置N+2个提取，多出的一个是PC（样品制备阳性对照），一个是NC（样品制备阴性对照）。可以用10μL上步所得4号稀释液再加上一定量的水使总体积跟每次样本制备所要求的起始样本体积一样，以此作为PC。另外用水作为NC。
8.用自选方法纯化样品的RNA，本试剂盒跟市场上大多数RNA提取试剂盒兼容，也可以选购本公司的免提取核酸释放剂。
三、Probe qPCR反应（20μL体系，在样品制备室进行）
9.如果做定量分析并且只做1次重复，则标记N+9个PCR管，其中N+2个用于上步得到的N+2个样品，1个用于PCR阴性对照（用水做模板），6个用于标准曲线。如果做定性分析并且只做1次重复，则标记N+4个PCR管，其中N+2个用于上步得到的N+2个样品，1个用于PCR阴性对照（用水做模板），1个用于PCR阳性对照（直接用第6步第4号管的阳性对照稀释液做模板）。下面只以定量分析为例描述操作步骤。
10.在标记管中按下表加入各成分（本表只列出一次重复。样品管和阴性对照设置完毕后才设置阳性对照，并且阳性对照样品要等所有管子盖上盖子储存好后最后加）：

成分                                                          样品管N+2个     PCR阴性对照    标准曲线样品管（1-6管）
2×Probe qPCR MasterMix                          各10μL               10μL                   各10μL
猪圆环病毒qPCR
引物-探针混合液                                         各3μL                  3μL                      各3μL
 N+2个待测DNA样本                                   各7μL                 不加                     不加
超纯水                                                          不加                   7μL                      不加
第6步所得标准曲线样品稀释液（1-6号）    不加                    不加                各7μL（1号样到1号管，2号样到2号管…）
11.盖上盖子后上机，按下面参数进行PCR：
过程                  温度     时间
预变性              95℃     5 min
PCR反应
（45个循环）    95℃    15 sec
                          60℃    1 min（采集FAM通道的荧光信号，淬灭基团为BHQ）
四、数据处理
12.如果把本试剂盒用于定量检测，则以阳性对照浓度的log值为横轴，以Ct值为纵轴，绘制标准曲线。再以待测样品的Ct值从标准曲线上推算出样品DNA浓度的log值，再推算出其浓度。
13.如果把本试剂盒用于定性检测，只判断阳性或阴性，则阴性对照必须无Ct或Ct大于或等于40。阳性对照必须有荧光对数增长，有典型扩增曲线，Ct值应该小于40，否则实验无效。如果实验有效，则分析待测样品，如果无Ct或Ct大于或等于40，则为阴性。如果Ct小于40则为阳性。

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