主要用途
植物 P 型氢 ATP 酶（H＋－ATPase）活性酶连续反应光度法定量检测试剂是一种旨在使用P 型氢 ATP 酶、 丙酮酸激酶和乳酸脱氢酶连续循环法反应系统，在特异性抑制剂存在与否的情况下，受到 P 型氢 ATP 酶的 水解产生的 ADP 过程中，伴随的还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）的氧化反应，即采用光度法测定 其氧化后吸光峰值（NADH 浓度）的变化，以此进行测算单位酶活性的权威而经典的技术方法。该技术经 过精心研制、成功实验证明的。其适合于各种植物组织，包括种子（seed）、叶片（leaf）、根（root）、胚胎 叶（cotyledon）、上胚轴（epicotyl）等 P 型 H＋-ATP 酶的特异性活性检测。产品不含污染性蛋白酶，严格无 菌，即到即用，操作简捷，性能稳定，反应优化，检测敏感。

技术背景
氢 ATP 酶（H＋-ATPase；EC3.6.3.6），又称为质子或氢离子转位 ATP 酶（Proton-Translocating ATPases），在 生物能量传导过程中起着重要作用。其分成三类：质膜型（plasma membrane type 或 P 型）、真细菌型（eubacterial type 或 F 型）和囊/液泡型（vacuolar type 或 V 型）。质膜型存在于植物、酵母和胃酸分泌型囊 泡的质膜上，约 100kd 蛋白；真细菌型存在于叶绿体、线粒体和细菌上，由疏水的膜部分和亲水的催化部 分组成；囊/液泡型存在于真核生物细胞器的囊泡系统。其中植物质膜氢 ATP 酶，100kd 分子量，是植物细 胞膜上重要的功能酶，为植物生命活动的主要酶之一。氢 ATP 酶催化三磷酸腺苷分解为二磷酸腺苷和无机 磷。这一去磷酸化反应释放出能量，成为细胞生命代谢的能源。同时利用细胞内ATP 释放的能量逆向跨质 膜把质子转运出细胞，产生并保持细胞膜或细胞器两侧氢离子的电化学梯度，为一系列次级转运体和通道 蛋白对各种营养物质及离子的跨质膜转运提供能量。植物氢 ATP 酶还参与细胞内 pH 水平、细胞伸长、气 孔开闭、以及植物对环境的应激反应等多种生理过程的调节。基于底物 ATP，在排除其它，包括钙（EGTA 处理）、钠钾（乌本苷；ouabain 处理）和氢钾（奥美拉唑；omeprazole）等 ATP 酶的干扰下，在 P 型氢 ATP 酶敏感性抑制剂原钒酸盐（orthovanadate）存在与否的情况下，受到 P 型氢 ATP 酶的水解，进而通过丙酮 酸激酶（pyruvate kinase；PK）和乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase；LDH）反应系统中，还原型烟酰胺腺 嘌呤二核苷酸（reduced nicotinamide adenine dinucleotide；NADH）转化为氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide；NAD），其峰值的变化（340nm），来定量分析 P 型氢 ATP 酶的活性。 其反应系统为：

产品内容
清理液（Reagent A）        毫升
裂解液（Reagent B）        毫升
缓冲液（Reagent C）        毫升
酶促液（Reagent D）    毫升
反应液（Reagent E）        毫升
底物液（Reagent F）        毫升
阴性液（Reagent G）    毫升
专性液（Reagent H）    微升
产品说明书        1 份

保存方式
保存在－20℃冰箱里，避免反复冻融；底物液（Reagent F），避免光照，有效保证 6 月

用户自备
15 毫升锥形离心管：用于样品制备的容器
1.5 毫升离心管：用于样品制备和保存的容器
DOUNCE 匀浆器：用于组织匀化
微型台式离心机：用于样品制备
培养箱：用于反应孵育
比色皿：用于光度分析的容器
分光光度仪：用于光度分析

实验步骤
实验开始前，将－20℃冰箱里的试剂盒中的试剂溶液置入冰槽里融化；底物液（Reagent F）注意避光；缓 冲液（Reagent C）室温下预热。然后进行下列操作。

一、 样品准备（总蛋白制备）
1 ． 准备好新鲜的植物组织（叶片、谷粒、种子等），并秤重以确定组织重量
2 ． （选择步骤）放进预冷的 15 毫升锥形离心管
3 ． （选择步骤）加入适量的（1 克组织需要 3 毫升）清理液（Reagent A）清洗 1 次
4 ． 即刻用刀片切碎组织
5 ． 放进一个预冷的 15 毫升锥形离心管
6 ． 加入预冷的 xx 毫升裂解液（Reagent B）
7 ． 涡旋震荡 5 秒，充分混匀
8 ． 即刻放进预冷的 DOUNCE 匀浆器，在冰槽里用匀浆棒匀化组织（约 80 下）
9 ． 将所有组织匀浆物移入 1.5 毫升离心管，放进 4℃微型台式离心机离心 10 分钟，速度为 5000g（或 7500RPM ，例如 eppendorf 5415）
10 ．小心移出上清液（注意：不要触碰沉淀物）到另一个新的预冷的 15 毫升锥形离心管
11．（选择步骤）如果上清液含有肉眼可见的残渣，重复离心 5 分钟一次，速度为 5000g（或 7500RPM， 例如 eppendorf 5415）
12 ．即刻移入到 1.5 毫升离心管
13 ．移取 10 微升进行蛋白定量检测（注意：建议使用Bradford 蛋白质浓度定量试剂盒－G&VS30030.1）
14 ．放进－70℃的冰箱里保存或置于冰槽里备用

二、测定准备
1 ． 准备好待测样品（例如植物组织细胞裂解样品等），置于冰槽里
2 ． 设定好分光光度仪（温度为28℃)：波长为 340nm ，间隔 5 分钟，读数 7 次（共 30 分钟），并置零

三、 背景对照测定
1 ． 移取 xx 微升缓冲液（Reagent C）到新的比色皿
2 ． 加入 xx 微升酶促液（Reagent D）
3 ． 加入 xx 微升反应液（Reagent E）
4 ． 加入 xx 微升底物液（Reagent F）
5 ． 放进 28℃培养箱里静置 3 分钟
6 ． 加入 xx 微升阴性液（Reagent G）
7 ． 上下倾倒数次，混匀（限定在 3 秒之内）
8 ． 即刻放进分光光度仪检测，此为背景空对照：340 波长读数 0 分钟 －340 波长读数 10 分钟或 30 分钟

四、 样品总活性测定
1 ． 移取 xx 微升缓冲液（Reagent C）到新的比色皿
2 ． 加入 xx 微升酶促液（Reagent D）
3 ． 加入 xx 微升反应液（Reagent E）
4 ． 加入 xx 微升底物液（Reagent F）
5 ． 放进 28℃培养箱里静置 3 分钟
6 ． 加入 50 微升待测样品（注意：100 微克总蛋白）
7 ． 上下倾倒数次，混匀（限定在 3 秒之内）
8 ． 即刻放进分光光度仪检测，此为样品总活性读数：340 波长读数 0 分钟 －340 波长读数 10 分钟或 30 分钟

五、 样品非特异活性测定
实验开始前，移取 50 微升待测样品（注意：100 微克总蛋白）到 1.5 毫升离心管，加入 xx 微升专性液（Reagent H）（注意：使用前需融化），混匀后，放进 28℃培养箱里孵育 15 分钟。然后置于冰槽里备用
1 ． 移取 xx 微升缓冲液（Reagent C）到新的比色皿
2 ． 加入 xx 微升酶促液（Reagent D）
3 ． 加入 xx 微升反应液（Reagent E）
4 ． 加入 xx 微升底物液（Reagent F）
5 ． 放进 28℃培养箱里孵育 3 分钟
6 ． 加入 60 微升上述预处理的待测样品
7 ． 上下倾倒数次，混匀（限定在 3 秒之内）
8 ． 即刻放进分光光度仪检测，此为样品非特异活性读数：340 波长读数 0 分钟 －340 波长读数 10 分钟或 30 分
钟

五、 计算样品活性
1）样品活性（总活性和非特异活性）

2）样品特异活性

注意事项
1 ． 本产品为 20 次操作，包括背景对照测定
2 ． 操作时，须戴手套
3 ． 系统操作过程中，背景测定只需 1 次
4 ． 建议样品忌用磷酸缓冲溶液、钠盐、钾盐、镁盐、EDTA、EGTA 等，可以使用 SUCROSE、IMIDAZOLE 等
5 ． 建议使用质膜样品为佳（植物组织质膜（plasma membrane）分离试剂盒—G&VS16022）
6 ． 加入样品启动反应后3 秒内即刻光度测定
7 ． 反应测定值由高到低变化；测定可以持续 30 分钟
8 ． 测定值由高到低变化，即 0 分钟测定读数高于 10 分钟或 30 分钟测定读数，表明有酶活性
9 ． 光度测定后，比色皿须清洗彻底
10 ．建议待测样本总蛋白浓度为 100 微克/50 微升；如果样本酶活性过低或过高，则可以增加或降低样本量； 注意计算公式的调整（本公司提供 Bradford 蛋白质浓度定量试剂盒 G&VS30030. 1）
11．P 型氢 ATP 酶活性单位浓度定义：在 28℃温度下，pH 7.5 条件下，每分钟内能够氧化 1 微摩尔还原型 烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）所需的酶量作为一个活性单位
12 ．本公司提供系列 ATP 酶类分析技术产品

质量标准
1 ． 本产品经鉴定性能稳定
2 ． 本产品经鉴定检测准确

使用承诺
上海极威生物科技有限公司秉着“信誉至上、客户满意、质量承诺”的宗旨为我们的用户提供优质产品和服务。用户收到货后， 应按照产品说明书上的规定妥善保管并在有效期内使用。我们的产品在销售前已作严格的质量鉴定，保证 说明书所述的使用效果。在货到后 10 天内若发现确属本产品的质量问题，请立即以书面形式（实验报告） 与本公司联系，并将该产品退回，经检验确系产品质量所致，本公司负责更换产品。如系使用者错误操作 所致，本公司不承担由此造成的损失。

友情提醒
IF IT DOESN’T WORK ， RECHECK YOUR EXPERIMENT TO SEE WHAT YOU DID WRONG。

订购信息
单组分订购信息

编号        名称                        规格
G&VS50244.5.2    植物 P 型氢 ATP 酶活性酶连续反应光度法定量检测试剂盒    20 次
G&VS50244.5.2A    清理液（Reagent A）                    毫升
G&VS50244.5.2B    裂解液（Reagent B）                    毫升
G&VS50244.5.2C    缓冲液（Reagent C）                    毫升
G&VS50244.5.2D    酶促液（Reagent D）                毫升
G&VS50244.5.2E    反应液（Reagent E）                    毫升
G&VS50244.5.2F    底物液（Reagent F）                    毫升
G&VS50244.5.2G    阴性液（Reagent G）                毫升
G&VS50244.5.2H    专性液（Reagent H）                毫升
G&VS30030. 1    Bradford 蛋白质浓度定量试剂盒                200 次

试剂盒订购信息
产品编号        名称                            规格
G&VS50244.5. 1    植物氢 ATP 酶（H＋－ATPase）总活性酶连续反应光度法定量检测试剂盒    20 次
G&VS50244.5.2    植物 P 型氢 ATP 酶（H＋－ATPase）活性酶连续反应光度法定量检测试剂盒    20 次
G&VS50244.5.3    植物 V 型氢 ATP 酶（H＋－ATPase）活性酶连续反应光度法定量检测试剂盒    20 次
G&VS50244.5.4    植物 F 型氢 ATP 酶（H＋－ATPase）活性酶连续反应光度法定量检测试剂盒    20 次