葡萄糖-6-磷酸( Glucose 6-phosphate， 6P G)含量测定试剂盒说明书

微量法 100 管/48 样
正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定

测定意义：
6PG (Glucose-6-phosphate，葡萄糖-6-磷酸，又称 6-磷酸葡萄糖)，是糖酵解和磷酸戊糖途径的中间产物，广泛存在于动植物体和微生物中。在糖酵解的第一步反应中，葡萄糖被己糖激酶催化生成葡萄糖-6-磷酸，然后通过磷酸葡萄糖异构酶的催化形成果糖-6-磷酸，以继续糖酵解的其它步骤；而在戊糖磷酸途径中，葡萄糖-6-磷酸是其第一个底物，该过程也是生成NADPH 的主要途径。此外，葡萄糖-6-磷酸也能转化形成糖原或淀粉而被储存起来。

测定原理：
6-磷酸葡萄糖脱氢酶可催化 6PG 和 NADP+生成 6 磷酸葡萄糖酸和 NADPH，NADPH 在1-mPMS 的作用下使 WST-8 显橙黄色，在 450 nm 下测定吸光值。

需自备的仪器和用品：
酶标仪、台式离心机、可调式移液器、96 孔板、研钵、冰、蒸馏水。
 
试剂的组成和配制：
提取液：液体 60 mL×1 瓶，4℃保存；
试剂一：液体 12mL×1 瓶， 4℃保存；
试剂二：粉剂×1 瓶，-20℃保存；
试剂三：液体 1.5mL×1 管， 4℃避光保存。

6PG 提取：
1、细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（10的4次方个）：提取液体积（mL）为 500~1000：1 的比例（建议 500 万细菌或细胞加入 1mL 提取液），超声波破碎（冰浴，功率 20％或 200W，超声 3s，间隔 10s，重复 30 次）， 8000g， 25℃离心 10min，取上清待测。
2、组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为 1：5~10 的比例（建议称取约 0.1g 组织， 加入 1mL 提取液），进行冰浴匀浆，8000g，25℃离心 10min，取上清待测。
3、血清（浆）等液体样品：直接测定。

测定步骤：
1、酶标仪预热 30min 以上，调节波长至 450nm。
2、试剂二的配制：临用前加入 3mL 水充分溶解待用，用不完的试剂分装后-20℃保存；
3、工作液的配制：临用前按照样本数量，按以下比例配制工作液

试剂名称（μL）        测定工作液           对照工作液
试剂一                                100                100
试剂二                                50
水                                                                50
试剂三                                10                     10

4、样本测定
按下表在 96 孔板中加入如下试剂
试剂名称（μL）                测定管                对照管
样本                                    50                        50
测定工作液                        150
对照工作液                                                    150

37℃避光孵育 30min，450nm 下测定吸光值A 测定与A 对照，△A=A 测定-A 对照。每个测定管需设一个对照管。

6PG 含量计算：
1、标准条件下测定回归方程为 y = 3.8589x - 0.0016，R2  = 0.997；x 为 6PG 含量（μmol/mL），y 为吸光值。

2、按照血清（浆）体积计算
6PG 含量（nmol/mL）= [(△A+0.0016)÷3.8589×V1]÷V1×1000
=259.1×(△A+0.0016)

3、按照蛋白浓度计算
6PG 含量（nmol/mg prot）= [(△A+0.0016)÷3.8589×V1]÷(V1×Cpr)×1000
=259.1×(△A+0.0016) ÷Cpr

4、按照样品质量计算
6PG 含量（nmol/g 鲜重）= [(△A+0.0016)÷3.8589×V1]÷(W ×V1÷V2）×1000
=259.1×(△A+0.0016) ÷W

3、按照细菌或细胞密度计算
6PG 含量（nmol/104 cell）= [(△A+0.0016)÷3.8589×V1]÷（500×V1÷V2）×1000
=0.518×(△A+0.0016)

V1：加入反应体系中样本体积，0.05mL；V2：加入提取液体积，1 mL； Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细菌或细胞总数，500 万；1000，μmol 到 nmol 的换算系数。