CAT#:JW-15-59800 低温运输，-20℃保存

牛病毒性腹泻病毒探针法 qRT-PCR 试剂盒
Bovine Viral Diarrhea Virus Probe qRT-PCR Kit

产品及特点       
  牛病毒性腹泻病毒（Bovine Viral Diarrhea Virus，BVDV)是一种 RNA 病毒 ，会引起牛病毒性腹泻 ，各种年龄的牛都易感染、 以幼龄牛易感性最高 。传染  来源主要是病畜 ，病牛的分泌物、排泄物、血液和脾脏等都含有病毒 ，以直接接  触或间接接触方式传播 。该病主要在消化道和淋巴组织 ， 口腔、 咽部、鼻镜出现  不规则烂斑、溃疡 ，以食道黏膜呈虫蚀样烂斑最具特征。流产胎儿的口腔、食道、 真胃及气管内有出血斑及溃疡 。运动失调的犊牛 ，严重的可见到小脑发育不全及  两侧脑室积水 ，给养殖业带来严重的经济损失 ，本产品就是以探针法荧光定量  RT-PCR 技术为基础开发的专门检测牛病毒性腹泻病毒的试剂盒，它具有下列特点：
1.   即开即用 ，用户只需要提供样品 RNA 模板。
2.   引物和探针经过优化 ，分析灵敏性高 ，可以达到 100 拷贝/反应。
3.   提供阳性对照 ，便于区分假阴性样品。
4.   特异性高 ， 引物是根据牛病毒性腹泻病毒 RNA 高度保守区设计 ，不会跟其他的 RNA 发生交叉反应。
5.   既可用于定性检测 ，又可用于定量检测 。 用于定量检测时线性范围至少为 5各数量级。
6.   本产品足够 50 次 20μL 体系的探针法 qRT-PCR 反应。
7.   本产品只能用于科研。

规格及成分                               本产品采用五孔盒包装

成分                                                                                  编号                规格             包装材料
探针法 qRT-PCR 缓冲液                                                    990504a         500 μL        0.5mL 蓝盖管
探针法 qRT-PCR 酶混合液 v2                                            990504bv2     50 μL          0.5mL 红盖管
荧光 PCR 专用模板稀释液                                                  180701            1 mL         1.5 mL 绿盖管
牛病毒性腹泻病毒 qRT-PCR 引物-探针干粉                        yp15-59800    50 次         0.5mL 棕色管
牛病毒性腹泻病毒 RT-PCR 阳 性对照(1×10E7 拷贝/μL)      pc59800          50 μL       0.5mL 黄盖管
使用手册                                                                               15-9800sc         1 份       无
注意 ：引物-探针干粉在使用前需要短暂离心 ，然后在离心管中加入 162uL 的超 纯水充分混匀后再使用 ，未用完的需要-20℃保存。
运输及保存  低温运输 ，-20℃保存 ，保存期限为 24 个月。
自备试剂  样品 RNA。

使用方法    
一、稀释标准曲线样品（以 10E1-10E6 拷贝/μL 这 6 个 10 倍稀释度为例） 。  由于标准品浓度非常高 ， 因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行 ，千万不能  污染样品或本试剂盒的其他成分） 。为增加产品稳定性和避免扩散传染性病原 ， 本产品不提供活体样品做阳性对照，只提供无传染性的 DNA 片段作为阳性对照。 如果需要 RNA 阳性样品 ，需要另外订购。
1.   标记 6 个离心管 ，分别为 6 ， 5 ， 4 ，3 ，2 ， 1。
2.   用带芯枪头分别加入 45μL 荧光 PCR 专用模板稀释液 ，最好用带芯枪头， 下同）。
3.   在 6 号管中加入 5μL 1×10E7 拷贝/μL  的阳性对照(试剂盒提供) ，充分震 荡 1 分钟 ，得 1×10E6 拷贝/μL 的标准曲线样品 。放冰上待用。
4.   换枪头 ，在 5 号管中加入 5μL 1×10E6 拷贝/μL  的阳性对照(上步稀释所  得)，充分震荡 1 分钟，得 1×10E5 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用。
5.   换枪头 ，在 4 号管中加入 5μL 1×10E5 拷贝/μL  的阳性对照(上步稀释所  得)，充分震荡 1 分钟，得 1×10E4 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用。
6.   重复上面的操作直到得到 6 个稀释度的标准曲线样品 。放冰上待用。

二、样品 RNA 的制备
7.   如果有 N 个样品，最好设置 N+2 个提取，多出的一个是 PC（样品制备阳性 对照） ，一个是 NC（样品制备阴性对照） 。可以用 10μL 上步所得 4 号稀 释液再加上一定量的水使总体积跟每次样本制备所要求的起始样本体积一 样 ， 以此作为 PC 。另外用水作为 NC。
8.   用自选方法纯化样品的 RNA，本试剂盒跟市场上大多数 RNA 提取试剂盒兼容 ，也可以选购本公司的免提取核酸释放剂。

三、Probe qRT-PCR 反应（ 20μL 体系 ，在样品制备室进行）
9.   如果做定量分析并且只做 1 次重复，则标记 N+9 个 RT-PCR 管，其中 N+2  个用于上步得到的 N+2 个样品，1 个用于 RT-PCR 阴性对照（用水做模板）， 6 个用于标准曲线 。 如果做定性分析并且只做 1 次重复 ， 则标记 N+4 个  RT-PCR 管 ，其中 N+2 个用于上步得到的 N+2 个样品 ， 1 个用于 RT-PCR  阴性对照（用水做模板） ， 1 个用于 RT-PCR 阳性对照（直接用第 6 步第 4  号管的阳性对照稀释液做模板） 。下面只以定量分析为例描述操作步骤。
10. 在标记管中按下表加入各成分（本表只列出一次重复 。样品管和阴性对照设 置完毕后才设置阳性对照，并且阳性对照样品要等所有管子盖上盖子储存好后最后加）：


成分                                                                样品管 N+2 个         RT-PCR 阴性对照      标准曲线样品管（ 1-6 管）    
探针法 qRT-PCR 缓冲液                                         各 10μL                    10μL                    各 10μL    
探针法 qRT-PCR 酶混合液 v2                                  各 1μL                     1 μL                    各 1 μL    
牛病毒性腹泻病毒 qRT-PCR 引物-探针混合液         各 3μL                     3μL                    各 3μL    
N+2 个待测 RNA 样本                                               各 6 μL                   不加                    不加    
超纯水                                                                       不加                        6 μL                     不加    
第 6 步所得标准曲线样品稀释液（ 1-6 号）              不加                       不加           各 6μL（ 2 号样 到 2 号管 ，3 号 样到 3 号管…）    

11. 盖上盖子后上机 ，按下面参数进行 RT-PCR：
过程                                    温度          时间
逆转录                                  50℃        15 min
预变性                                  95℃        5 min
PCR 反应    （45 个循环）    95℃      15 sec
                                              60℃       60 sec（采集 FAM 通道的荧光 信号,淬灭基团为 3`BHQ1）
四、数据处理
12. 如果把本试剂盒用于定量检测 ，则以阳性对照浓度的 log 值为横轴 ， 以 Ct 值为纵轴 ，绘制标准曲线 。再以待测样品的 Ct 值从标准曲线上推算出样品 RNA 浓度的 log 值 ，再推算出其浓度。
13. 如果把本试剂盒用于定性检测 ，只判断阳性或阴性 ，则阴性对照 Ct 必须没有读数 ， 或者大于或等于 40 。 阳性对照必须有荧光对数增长 ，有典型扩增 曲线 ，Ct 值应该小于 40 。对待测样品 ，如果其 Ct 没有读数、 大于或等于 40 则均为阴性 ，如果小于 40 则为阳性。

关联产品    牛病毒性腹泻病毒可视化染料-荧光染料RT-LAMP试剂盒