CAT#:JW-960906-50 低温运输,-20℃保存

产品及特点    
本试剂盒提供合成 cDNA 第一链（逆转录） 所需要的全部试剂 。其原理是用突变  的莫洛尼氏鼠白血病病毒反转录酶（M-MuLV RT）以 RNA 为模板，高效合成 cDNA。 它具有下列特点：
1.   使用突变的反转录酶 ， 内源 RNase H 活性低 ，使得在逆转录过程中 RNA 模板不容易被降解 ，得到的 cDNA 平均长度更长。
2.   最长可合成 13 Kb 的 cDNA。
3.   可以使用 oligo-dT、随机引物和 RNA 专一性引物三种引物（前两种本试剂盒提 供）。
4.   总 RNA、poly(A)+RNA 或特殊 RNA 均可作为模板。
5.   得到的 cDNA 可用于后续的 cDNA 文库构建、 RT-PCR、探针标记等。
6.   本产品足够 50 次 20uL 体系的逆转录反应。
7.   本产品只能用于科研。

规格及成分    
本产品使用五孔盒包装

成份                                               编号             规格             包装
MMLV（含 RI）                           960906a        50 uL           0.5mL 红盖管
4×RT Buffer（含 dNTP）             960906b        250 uL        0.5mL 绿盖管
Oligo (dT) 12-18 引物干粉            220629          25ug           0.5mL 白盖管
随机引物(6 碱基 ，无修饰)干粉    220574          10ug            0.5mL 黄盖管
超纯水                                           210806          1 mL            1.5mL 蓝盖管
使用手册                                       960906sc        1 份            无
注意 ：首次使用本产品时 ， 需要在 Oligo (dT) 12-18 引物干粉管中加入 50uL  超纯 水 ， 涡旋震荡半分钟混匀 ，得到 0.5ug/uL 的 Oligo (dT) 12-18 引物溶液； 需要在 随机引物 (6 碱基 ，无修饰) 干粉管中加入 50uL 超纯水 ，涡旋震荡半分钟混匀 ，得 到 0.2ug/uL 的随机引物溶液 。没有用完的引物需要放置在-20℃保存。

运输及保存：低温运输 ，-20℃保存 ，有效期一年。

使用方法    
一 ：合成 PCR 用的 1st-strand cDNA
1.   在一干净的反应管中加入 RNA 模板 。注意 ：RNA 模板不能含有基因组 DNA 污
染。
RNA 模板种类              加入量    
总 RNA                        100-500 ng    
或 poly(A) mRNA        10-500 ng    
或专一的 RNA             0.01 pg-500 ng

2.   加入引物和水

引物种类                                                       加入量
Oligo (dT) 12-18 ，0.5 ug/uL                       1 uL
或随机引物(6 碱基 ，无修饰)， 0.2 ug/uL    1 uL
或 RNA 模板专一性引物                                15-20 pmol
注意： 随机引物与 RNA 模板的比例跟 cDNA 合成的平 均长度成反比。
3.   加水到 13 uL 。
4.   70℃保温 5 分钟后立即冰浴 ， 此步可以打开 RNA 的二级结构。
5.   再加入 5 uL 4×RT Buffer（含 dNTP）。
6.   37℃保温 5 分钟 。对富含二级结构的高 GC RNA  模板 ，可以改成 45℃保温 5 分钟 。但如果使用随机引物 ， 由于其很短 ，则改成 25℃ 5 分钟以便其跟 RNA  结合。
7.   加入 1 uL MMLV 逆转录酶（含 RI） ，反应终体积为 20 uL。
8.   42℃保温 60 分钟 。但如果使用随机引物 ，需要先 25℃保温 10 分钟 ，待合成 了一段 cDNA 后 ，然后再转移到 42℃保温 60 分钟 。此步为 RT 反应。
9.   70℃保温 10 分钟以终止反应 ，然后放置在冰上待用 。合成的 cDNA 可以直接 作为 PCR 模板使用 ，不需要纯化。

二 ：合成建文库用的 1st-strand cDNA
1.   在一干净的反应管中加入 RNA 模板 。注意 ：RNA 模板不能含有基因组 DNA 污染。

RNA 模板种类    加入量
poly(A) mRNA    1ug
或专一的 RNA    0.5-1 ug

2.   加入引物
引物种类                                                   加入量
Oligo (dT) 12-18 ，0.5 ug/uL                    1 uL
或随机引物(6 碱基 ，无修饰) 0.2 ug/uL    1 uL
或 RNA 模板专一性引物                            100 pmol
注意： 随机引物与 RNA 模板的比例跟 cDNA 合成的平均长度成反比。    
3.   加水到 13uL。
4.   70℃保温 5 分钟后立即冰浴 ， 此步可以打开 RNA 的二级结构。
5.   再加入 5 uL 4×RT Buffer（含 dNTP）。
6.   37℃保温 5 分钟 。对富含二级结构的高 GC RNA  模板 ，可以改成 45℃保温 5 分钟 。如果使用随机引物 ，则改成 25℃ 5 分钟。
7.   加入 2 uL MMLV 逆转录酶（含 RI） ，反应终体积为 20uL。
8.   42℃保温 60 分钟 ，但如果使用随机引物 ，需要先 25℃保温 10 分钟 ，然后再 转移到 42℃保温 60 分钟 。此步为 RT 反应。
9.   70℃保温 10 分钟以终止反应 ，放置在冰上待用 。合成的 cDNA 可以用于第二 链 cDNA 的合成或放置在-20℃长期保存。

关联产品    两管式 RT-PCR 试剂盒