CAT#:JW-971201-50 常温运输和保存    

产品及特点    
本产品用于从各种动物组织（包括白细胞） 快速提取总 RNA 。它具有下列 特点：
1.   操作简单快速，整个过程只需要不到十分钟（对一个样品而言）。
2.   RNA 纯度更高，OD260/OD280 一般在 2.0 左右。
3.   一般不含用 RT-PCR 可以检测到的基因组 DNA 污染。
4.   适用于培养细胞、大部分动物组织和部分植物组织。
5.   得到的 RNA 可直接用于 RT-PCR、Northern 杂交、cDNA 合成等实验。
6.   性价比高于进口的柱式 RNA 提取产品。
7.   可以进行无氯仿操作，只是纯度稍微降低，但不影响使用。
8.   本产品足够 50 次微量柱式提取，每次可以处理 100mg 左右的组织。
9.   本产品只能用于科研。

规格及成分    
本产品使用大纸盒包装
成份                                         编号                规格         包装
动物 RNA 纯化溶液 A             971201a         50 mL        60mL 棕色瓶
动物 RNA 纯化溶液 B             971201b         25 mL        30mL 本色瓶
离心吸附柱                              211207           50 套         塑料袋
通用洗柱液                              220143           50 mL        60mL 本色瓶
RNA 洗脱液                             971207           10 mL        10mL 本色瓶
使用手册                                  971201sc        1份            无

运输及保存：常温运输和保存，溶液 A 需要放 4℃长期保存，有效期一年。
自备物品：氯仿， 台式离心机

使用方法：下面的操作步骤是针对在 1.5 mL 塑料离心管中进行的微量提取的，如果处理 样品量大，请按比例增加各成份的用量并使用大的离心管和离心机。
1.   根据组织细胞类型的不同分为下面及种情况使用：
a)   对贴壁细胞：吸尽培养液，在每 10 平方厘米细胞中加入 1 mL 动物 RNA纯化溶液 A，用枪轻柔吹打数次，确保细胞全部裂解并且让基因组 DNA 充 分断裂。
b)   对悬浮细胞：离心收集细胞，吸尽液体，在每 1-5×106 悬浮细胞中加入 1 mL 动物 RNA 纯化溶液 A，用枪轻柔吹打数次 ，确保细胞全部裂解并且让 基因组 DNA 充分断裂。如果是 fibroblasts 或 carcinoma cell， 1 mL 溶 液 A 的细胞使用量不要超过 1×10E6 个细胞。
c)   对新鲜组织：先将剪切成小块新鲜组织或液氮保存的组织放入  10  mL  或15 mL 塑料离心管中，每 50-100 mg 组织加 1 mL 动物 RNA 纯化溶液 A， 用 Polytron 剪切式匀浆器匀浆 30 秒左右。对肝、脾、胰、肾等细胞分裂  十分旺盛的组织（细胞中含大量正在复制的 DNA），建议组织的使用量不  要超过 50 mg/mL 动物 RNA 纯化溶液 A，否则十分容易产生 DNA 污染。 也可以用液氮研磨：在研钵中加入液氮，再加入 50-100mg 新鲜组织，然  后研磨成粉后转移到 1.5mL 离心管中，再加入 1mL 动物 RNA 纯化溶液 A， 震荡 30 秒混匀。
d)   对非冻型组织 RNA 保存液或 RNAlater 等保存液保存的组织：先用纸吸去 保存液后再剪切成小块，其余操作同新鲜组织的处理。
2.   如果进行无氯仿操作（所得 RNA 纯度稍低，但一般不影响后续使用），则 将上步所得的细胞裂解物或匀浆液转移至一个干净的 1.5 mL 塑料离心管 中， 12,000 rpm 室温离心 3-5 分钟。
3.   如果进行带氯仿操作（所得 RNA 纯度比免氯仿操作稍高）， 则将上步所得 的细胞裂解物或匀浆液转移至一个干净的 1.5 mL 塑料离心管中 ，然后加 入 0.2 倍体积的自备氯仿(1 mL 动物 RNA 纯化溶液 A 需 0.2 ml 氯仿) ， 振荡器上充分振荡混均 30 秒， 12,000 rpm 室温离心 3-5 分钟。
4.   将上清液转移到一个干净的 2  mL 塑料离心管中。注意：  无氯仿操作时，  离心后管底是细胞碎片和结缔组织纤维。带氯仿操作时，离心后分上下层， 下层有机相和上下层中间含有 DNA 和蛋白质，吸取上清时避免触及，否  则将产生蛋白质和 DNA 污染。为保险起见，可以留下 100 μL 上清液不取。 同时吸取上清时最好缓慢进行。
5.   加入等体积的动物 RNA 纯化溶液 B ，充分颠倒混匀。
6.   分次（一般需要 2-3 次）将加入动物 RNA 纯化溶液 B 后的混合液转移到  离心吸附柱中， 12,000 rpm 室温离心半分钟，弃穿透液。如果溶液粘稠， 可以延长离心时间到 2 分钟。
7.   加 0.7 mL 通用洗柱液到离心吸附柱中， 12,000 rpm 室温离心半分钟，弃收集管中的穿透液。一次洗涤一般足够去除杂质。
8.   再加 0.3 mL 通用洗柱液到离心吸附柱中， 12,000 rpm 室温离心半分钟，弃穿透液 。此步可以省略。
9.   再室温 12,000 rmp 干甩半分钟。此步十分重要，否则残留的通用洗柱液会影响 RNA 的使用。
10. 将离心吸附柱转移到一自备的 RNase-free1.5mL 塑料离心管中， 加入 50-100 uL RNA 洗脱液。
11. 室温 12,000 rmp 离心半分钟，离心管中溶液即为 RNA 样品，可以立即 使用或存放于-80℃待用。
12. RNA 的电泳检测：本试剂盒提取的 RNA 最好用甲醛变性胶电泳，如果在 非变性的普通琼脂糖胶（in TAE 或 TBE buffer）上电泳，一定要使用 RNA 专用上样液，千万不要使用常用的 DNA 上样液，因为DNA 上样液没有经 过去 RNase 处理，也不能将 RNA 变性，得到的带型将十分杂乱。
13. RNA 完整性的电泳检测：如果需要做 Northern 杂交，强烈建议用户使用 甲醛变性胶进行 RNA  电泳， 因为非变性胶不能分离所有的  RNA 分子 （BioTechniques ，28 ：414 ，2000）。
14. RNA 产量产率测定：将 5-10 μL RNA 溶于 TE 缓冲液中(pH7.5-8.2 之间) 检测其在 OD260 的光吸收 。通过光吸收可以得出 RNA 浓度（ 1 OD260 的 RNA=40 μg/mL），进而计算出 RNA 的产量（浓度 X 体积)和产率(RNA 产量/组织用量)。
15. RNA 纯度测定：无污染的总 RNA 的 OD260/OD280 一般在 1.8-2.1 之 间(具体数值与其碱基组成和溶液成分等多种因素有关)，高于此范围则分别 表示样品可能有蛋白质污染，但一般不影响 RT-PCR 等反应。

疑难解答    
Q：上样孔里的红色荧光物一定是 DNA 污染吗？
A：不是。用 TAE 或 TBE 电泳液和非变性胶电泳 RNA 时容易产生此现象，本 公司初步研究发现大部分红色荧光物是变性不充分的单链 RNA 通过碱基互 补或通过硼酸络合（如果使用 TBE 作电泳液的话）形成的复合物，加RNase 处理后，这些红色荧光物(RNA)一般会消失。为避免此现象，建议最好使用 甲醛变性胶电泳和 RNA 专用上样液。
Q ：如何确认和去处除污染的基因组DNA？
A：如果怀疑有 DNA 污染，可以用RNase 处理 RNA 样品，然后再电泳。如果 上样孔里的红色荧光物不消失，则表示是基因组 DNA 污染。进一步确认可 以使用 PCR 扩增法。去除污染的 DNA 可以使用本公司的 RNase-free DNase。
关联产品：DNA 清除剂（过柱法）