CAT#:JW-990505-1低温运输 ，-20℃保存
产品及特点
本产品是基于 Tth DNA 聚合酶的荧光探针法 RT-PCR MasterMix ，它含有经
过优化的缓冲液组分、Tth DNA 聚合酶、dNTPs、MgCl2 等所有实时定量 RT-PCR 所需要的成分。与常用的 MMLV-Taq DNA 酶 RT-PCR 体系相比，它们的区别如下：
本产品具有下列特点：
1.方便 ， 用户只需准备模板、 引物和探针即可以进行探针法 qRT-PCR 实验。
2.产品为 2×预配液，操作步骤已经最大限度地简化，能减少污染，降低实验误差。
3.60-70℃进行 RT-PCR ，避免了 RNA 二级结构打不开问题和非特异扩增问题。
4.各成分的浓度和比例都经过精心优化 ，反应的灵敏度高 ，特异性强。
5.本规格有 1mL ，足够 100 次 20uL 体系的探针法荧光定量 RT-PCR。
6.比进口同类产品性价比更高。
7.本系列产品只可用于科研。
规格及成分
本产品采用塑料袋包装
成分 编号 规格 包装
2×探针法 Tth qRT-PCR MasterMix 990505 1 mL 1.5mL 棕色管
使用手册 990505sc 1 份 无
运输及保存：低温运输 ，-20℃保存 ，保存期限为 12 个月。
自备试剂：待测 RNA 模板、 阳性对照 RNA 模板、 引物、探针、超纯水。
使用方法
1. 按下表设置探针法 Tth qRT-PCR 反应 ， 以一个样本为例：
成分 样品管 阴性对照 阳性对照
2×探针法 Tth qRT-PCR MasterMix 10 μL 10 μL 10 μL
自备引物 1 和引物 2（ 10μM each） 各 1μL 各 1μL 各 1μL
TaqMan 探针（ 5μM） 1μL 1μL 1μL
自备模板 RNA（ 100ng-1μg） 1-2μL
阳性对照 RNA 模板（ 100ng-1μg） 1-2μL
补超纯水到 20μL 20μL 20μL
2. 放入荧光 PCR 仪中进行扩增 ，下表的扩增参数仅供参考 ，一般需要根据靶分子长度 ， 引物的 Tm值等进行调节 。一般选择三步法 PCR：
步骤 温度 时间
逆转录（ RT 步骤） 60-70℃ 30 min（具体温度根据引物 Tm 决定）
预变性 95℃ 3 min
PCR（ 35-45 次循环） 95℃ 15 sec
55-65℃ 15-30 sec
72℃ 30 sec（根据探针的荧光标记 选择对应的荧光通道）
如果引物 Tm值接近 60℃ , 也可以选择两步法 PCR：
步骤 温度 时间
逆转录（ RT 步骤） 60-70℃ 30 min（具体温度根据引物 Tm 决定）
预变性 95℃ 3 min
PCR（ 35-45 次循环） 95℃ 15 sec
60℃ 60 sec（根据探针的荧光标记 选择对应的荧光通道）
3.定量分析数据处理： 以 6 个 10 倍稀释的标准曲线样本的浓度的 log 值为横轴， 以 Ct 值为纵轴 ，绘制标准曲线 。再以待测样品的 Ct 值从标准曲线上推算出样 品 DNA 浓度的 log 值 ，再推算出其浓度。
4.定性分析数据处理 ：阴性对照 Ct 大于或等于 40（此处为便于叙述姑且以 40 为 例，具体设置成多少需要用户根据引物探针的具体情况测试确定）。阳性对照必 须有荧光对数增长，有典型扩增曲线 ，Ct 值应该小于 40 。如果对照结果不能满 足上述条件，则实验无效，不需要分析待测样本数据 。如果满足上述条件，表示 实验有效 ，则可以继续分析待测样本 。对待测样品 ，如果其 Ct 大于或等于 40 则为阴性 ，如果小于 40 则为阳性。
关联产品 染料法 Tth qRT-PCR 试剂盒
