多胺氧化酶（Polyamine oxidase，PAO）试剂盒说明书

微量法 100 管/96 样
正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定

测定意义：
多胺氧化酶是催化生物体内多胺氧化的关键酶，通过调节体内多胺水平和生成物的浓度，参 与各种植物体对逆境胁迫的反应和生长发育过程。

测定原理：
PAO 催化多胺氧化产生过氧化氢，在过氧化物酶存在的条件下与底物显色，在 550nm 下有特征吸收峰，通过测定吸光值增加速率来反映 PAO 活性。

需自备的仪器和用品：
酶标仪、台式离心机、可调式移液器、96 孔板、研钵、冰和蒸馏水。

试剂组成和配制：
试剂一：液体 120mL× 1 瓶，4℃保存；
试剂二：液体 3mL× 1 瓶，4℃保存；
试剂三：液体 1.5mL× 1 瓶，4℃保存；
试剂四：液体 1.5mL× 1 瓶，4℃保存。

粗酶液提取：
1.    组织：按照组织质量（g）：试剂一体积(mL)为 1：5~ 10 的比例（建议称取约 0. 1g 组织， 加入 1mL 试剂一）进行冰浴匀浆，然后 10000g，4℃离心 20min，取上清，置冰上待测。
2.    细菌、真菌：按照细胞数量（104 个）：试剂一体积（mL）为 500~ 1000：1 的比例（建 议 500 万细胞加入 1mL 试剂一），冰浴超声波破碎细胞（功率 300w ，超声 3 秒，间隔 7 秒，总时间 3min）；然后 10000g ，4℃ , 离心 10min ，取上清置于冰上待测。
3.    血清等液体：直接测定。

测定步骤：
1 、 酶标仪预热 30min 以上，调节波长至 550nm。
2 、 样本测定

试剂名称(µL）    测定管
试剂一        140
试剂二        20
试剂三        10
样本        20
试剂四        10
迅速混匀，于 550nm 下测定初始吸光值 A1 与 30min 后吸光值 A2 。ΔA=A2-A1。

PAO 活性计算：
（1）按样本蛋白浓度计算：
单位定义：每 mg 组织蛋白在每mL 反应体系中每分钟 A550 变化 0.001 为一个酶活力单位。 PAO（U/mg prot）= ΔA×V 反总÷（V 样×Cpr）÷0.001÷T =333.33×ΔA÷Cpr
（2）按样本鲜重计算：
单位定义：每 g 组织在每mL 反应体系中每分钟 A550 变化 0.001 为一个酶活力单位。 PAO（U/g  鲜重） = ΔA×V 反总÷(W× V 样÷V 样总)÷0.001÷T =333.33×ΔA÷W
（3）按细菌或细胞密度计算：
单位定义：每 1 万个细菌或细胞在每mL 反应体系中每分钟 A550 变化 0.001 为一个酶活力单位。
PAO（U/104 cell）= ΔA×V 反总÷(500×V 样÷V 样总)÷0.001÷T =0.667×ΔA
（4）按液体体积计算
单位的定义：每 mL 液体样本在每mL 反应体系中每分钟 A550 变化 0.001 为一个酶活力单 位。
PAO（U/mL）=ΔA×V 反总÷V 样÷0.001÷T =333.33×ΔA
V 反总：反应体系总体积，0.2mL；V 样：加入样本体积，0.02 mL；V 样总：加入提取液体 积，1 mL；T：反应时间，30 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500： 细菌或细胞总数，500 万。