低温运输 ，-20℃保存

凋亡 DNA 定量试剂盒（qLM-PCR 法） Apoptotic DNA SYBR LM-qPCR Kit使用手册

产品及特点    
细胞凋亡显著特点之一是细胞染色体被一种内源性核酸内切酶降解 ，产生长度为 180-200bp 的整倍数的 DNA 片段，称之为凋亡 DNA Ladder 。由于只有凋亡细胞才产 生凋亡 DNA Ladder， 因此检测凋亡 DNA Ladder 对筛选哪些药物或处理可以调控细 胞凋亡具有重要的指导意义。但凋亡细胞一般只占总细胞的很少比例，故通过常规方法检测不是灵敏度低 ，就是步骤繁琐 ，为此本公司开发了基于 Linker Mediated-PCR（LM-PCR） 的凋亡 DNA 实时荧光定量试剂盒 ，它具有下列特点：
1.   一站式 ，用户不需要单独优化实验条件。
2.   用于实时定量检测总 DNA 中所含的凋亡 DNA。
3.   起始材料为总 DNA，免去单独提取凋亡 DNA 步骤。同时比细胞材料保存更方便。
4.   利用染料法荧光定量 LM-PCR ，整个过程只要两小时（不含 DNA 纯化）。
5.   灵敏度比 TUNEL/FACS 、Annexin-V/FACS 和 caspase ELISA 等常规方法更高，最低可以检测到 pg 级别的凋亡 DNA（相当于不到 100 个凋亡细胞）。
6.   可以进行定性分析 ，也可以进行绝对定量分析。
7.   定量分析时可计算出平均每个细胞中有多少凋亡 DNA ，线性范围在 3 个数量级。
8.   本产品可以根据客户需求升级为单细胞凋亡 DNA 检测。
9.   本产品足够 50 次实验。
10.  本产品只能用于科研。

规格及成分    
本产品采用 10 孔盒包装

成份                                                    编号           规格               包装
LM-PCR Linker 干粉                     220316a         50 次         1.5 mL 黄盖管
连接反应液（待加 linker）            220316b         1 mL         1.5 mL 绿盖管
LM-PCR 通用引物干粉                 220316c          50 次         1.5 mL 白盖管
荧光 PCR 专用模板稀释液           180701            1 mL         1.5 mL 绿盖管
T4 DNA Ligase ，350U/μL       11-T220758       50  μL         0.5mL 红盖管
2×SYBR qPCR MasterMix           990408           0.5 mL         0.5 mL 棕色管
超纯水                                           210806          1 mL         1.5mL 蓝盖管
使用手册                                       220316sc        1份                 无
注意：首次使用时需要将连接反应液（待加 linker）全部转移到 LM-PCR Linker 干粉 管中，得到已加 Linker 的连接反应液 。同时 ，需要加入 55μL 超纯水到 LM-PCR 通用引物干粉中 ，涡旋震荡混匀 。一次实验没有用完的需要-20℃保存。

运输及保存：低温运输、-20℃保存、有效期一年。
自备试剂：细胞总 DNA 纯化试剂盒 ，凋亡 DNA 纯化试剂盒 ，细胞凋亡诱导试剂

使用方法    
一、 制备待测样品的总 DNA
1.    制备 N 个样品的总 DNA（含基因组 DNA 和凋亡 DNA），需要在纯化前准确进 行细胞计数 。所需起始细胞数量需参考所用 DNA 纯化试剂手册 。得到 DNA 后 需测 OD260 以确定其浓度和产量。一个人体细胞含有 6.64pg DNA，可以通过预 期总 DNA 产量和实际 DNA 产量计算出总 DNA 的产率。最后用自备的 TE 缓冲 液将所有待测样品的总 DNA 浓度稀释到 5ng/μL，放冰上待用。也可以分装成 N个小份放-20℃保存 。本试剂盒不含相关试剂。

二、 制备凋亡 DNA标准曲线样品（定性检测可以跳过此步）
2.    用可以诱导细胞凋亡的条件处理已知数量的培养细胞，诱导细胞凋亡，然后纯化 凋亡 DNA，并电泳确认得到凋亡 DNA Ladder，并且没有基因组 DNA 残留 。一 个人体细胞含有 6.64pg DNA，可以通过预期总 DNA 产量和实际凋亡 DNA 产量 计算出凋亡 DNA 的产率。将凋亡 DNA 的浓度用 TE 缓冲液调到 25ng/μL，此溶液将作为 PCR 反应时的阳性对照 。本试剂盒不含上述实验相关试剂。

三、 制备凋亡 DNA标准曲线样品的 4倍梯度稀释液（定性检测可以跳过此步）
3.    标记 6 个离心管 ，分别为 1-6。
4.    用带芯枪头（下同）分别加入 30  μL  荧光 PCR 专用模板稀释液。
5.    在 1 号管中加入 10  μL  凋亡 DNA 阳性对照 ，充分震荡 1 分钟 ，得 1 号稀释液。

6.    换枪头 ，在 2 号管中加入 10  μL 1 号稀释液 ，充分震荡 1 分钟 ，得 2 号稀释液。
7.    重复上面的操作直到得到 6 个稀释液 ，全部放冰上待用。

四、Linker 连接反应
8.    如果做定性分析：标记 N+2 个 PCR 管 ，其中 N 个用于第一步得到的 N 个待测 样品 ，1 个用于阴性对照 ，1 个用于阳性对照 。如果做重复 ，则按比例增加样品的反应管数量 。各成分加样量如下：
成分                                                              样品管 N 个          阴性对照          阳性对照
连接反应液（含 LM-PCR Linker）                各 19  μL                19  μL           各 19  μL
N+2 个待测样本（5ng/μL）                                各 20 μL              不加               不加
第 1 步所得凋亡 DNA 标准曲线样品（25ng/μL）    不加               不加               4 μL
超纯水                                                                  不加                  20 μL              17 μL
T4 DNA 连接酶                                                    各 1  μL             1 μL               各 1 μL
9.    如果做定量分析：标记 N+7 个 PCR 管 ，其中 N 个用于待测样品 ，1 个用于阴性 对照 ，6 个用于标准曲线 。如果做重复 ，则按比例增加样品的反应管数量 。各成分加样量如下：
        成分                                          样品管 N 个           阴性对照            6个标准曲线管    
连接反应液含 LM-PCR Linker）          各 19 μL             19  μL                 各 19  μL    
N+2 个待测样本（5ng/μL）                 各 20 μL              不加                  不加    
第 7 步所得 6 管凋亡 DNA 稀释液        不加                   不加            各 20 μL(1 号到 1 号 管……）    
超纯水                                                  不加                     20 μL                  不加    
T4 DNA 连接酶,10U/μL                      各 1  μL                   1 μL                  各 1 μL    
10.   总体积为 40μL 体系 ，16℃过夜保温 16 小时。
11.   加 360μL 超纯水 ，将连接产物稀释 10 倍。

四、PCR 反应
12. 在 0.2 mL 离心管中设置 N+2 个（对定性实验）或 N+7 个（对定量实验）PCR 体
系 。在每管中分别加入的成分：
成分                                                                             体积
连接液产物的 10 倍稀释液（来于第 12 步）               9 μL
LM-PCR 通用引物                                                       1 μL
试剂盒提供的 SYBR PCR Mix                                   10  μL
13. 离心数秒，按下列参数进行 PCR 扩增：预合成 72℃ 4 分钟（不是 94℃变性），然 后 PCR 循环 40 次（94℃1 分钟，72℃43 分钟，采集 SYBR 通道的荧光信号）。由于凋亡 DNA 片段长短不一 ，故不能设置溶解曲线分析。

五、数据分析
14. 判断实验有效性： 如果阴性对照出现阳性结果（有倒 S 型荧光信号 ，Ct 在 35 以  下），则整个实验结果无效。可能是污染或其他原因，需要找到原因后才能继续。 如果阳性对照出现阴性结果，则整个实验结果也无效，需要找到原因后才能继续。如果阳性结果为阳性， 阴性结果为阴性 ，则实验有效 ，可以继续分析。
15.   如果是定性检测 ，只判断待测样本阳性或阴性 。如果其 Ct 没有读数、大于或等于 40 则均判为阴性 ，如果小于 40 则为阳性。
16.   如果是定量检测 ，则以标准曲线样本的 log 值为横轴， 以 Ct 值为纵轴 ，绘制标 准曲线 。再以待测样品的 Ct 值从标准曲线上推算出样品凋亡 DNA 的浓度的 log 值 ，再推算出其浓度 。再根据凋亡 DNA 的产率 ，推算出纯化出这些凋亡 DNA需要多少细胞 ，最后得出每个细胞有多少凋亡 DNA。

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