CAT#:JW-230650
低温运输，-20℃保存

RNA 定量试剂盒（RiboGreen 法） Skygen RNA Quantification Kit

产品及特点    
RiboGreen 染料是一种超灵敏的荧光核酸染料 ，用于溶液内 RNA 的定量 检测 。在大量分子生物学实验过程中对微量 RNA 的检测和定量特别重要 ，这  些过程包括 ：体外转录 RNA 产量的测定 ， 以及在进行 Northern Blot、S1 核 酸酶实验、RNase 保护实验、cDNA 文库制备、逆转录 PCR 和差异显示 PCR 前对 RNA 浓度的测定 。核酸浓度测定最常见的方法是测量 260 nm 波长处的 吸光值（A260） ，然而 ，基于吸光值检测法主要的缺点在于蛋白和游离核苷  酸对光信号具有较大的干扰 ， 以及检测灵敏度较低（A260=0. 1 相当于溶液中 4μg/mL 的 RNA） ；而应用灵敏的荧光核酸染料能避免很多由于这些因素引  起的问题。本试剂盒就是基于 RiboGreen 法对 RNA 进行定量的试剂盒，它具有下列特点：
1.   探针与 RNA 结合后的最大激发波长~500nm ，最大发射波长~525nm。
2.   通过荧光酶标仪、标准的荧光光度计或滤光荧光计来测量 ，能定量浓度低至 1 ng/mL 的 RNA。
3.   灵敏度高 ，200μL 的反应体系可检测低至 200pg RNA ，这一灵敏度比基 于溴化乙锭的荧光分析法高 200 倍，比基于紫外吸收峰的分析法高 1000倍。
4.   使用两个染料浓度 ，为 200×（ High-range assay） 和 2000×（Low-range assay），即使体系内存在核酸制备物中常见的几种杂质（包 括 ：核苷酸、 盐类、尿素、 乙醇、氯仿、表面活性剂、蛋白和琼脂糖），RiboGreen 染料可测量的 RNA 浓度线性范围仍能达 3 个数量级 ，从1ng/mL 到 1μg/mL RNA 。其中 ，高宽度实验（High-range assay）能 定量 1ng/mL-50ng/mL 的 RNA ，低宽度实验（Low-range assay）能定量 1ng/mL-50ng/mL 的 RNA。
5.    由于 RiboGreen 染料也会结合 DNA ，需先用 DNase 预处理混合样品，再用 RiboGreen 染料进行 RNA 选择性的定量分析。
6.   本品以溶于 DMSO 的母液形式提供。
7.   本产品可供 2 mL 体积的 20 次 RNA 的高宽度定量 ，200 次 RNA 的低宽度定量。
8.   本产品只能用于科研。

规格及成分    
本产品使用塑料袋包装
成分                   编号    规格    包装
RiboGreen 染料    230650    100 μL    1.5 mL 棕色管
使用手册                  230650sc    1 份    无
                
运输及保存：低温运输 ，-20℃避光保存 ，有效期一年。
自备试剂：RNA 样品 ，无核酸酶水 ，20×TE 缓冲液（RNase-free） ，RNA Standard， 荧光比色皿以及荧光光度计/全黑 96 孔板以及荧光酶标仪 ， 10×DNase digestion buffer ，无核糖核酸酶的 DNase I。

使用方法    一、反应缓冲液准备
1.   于实验前，将 20×TE 缓冲液（RNase-free）用无核酸酶水稀释到 1×TE 缓冲液 ，用于稀释 RiboGreen 染料和 RNA 样品 。注意：必须保证 TE 缓冲液没有受到核酸及核酸酶的污染。

二、确定染料浓度
2.   在 RiboGreen染料的 RNA 定量检测中，为了获得完全的线性动力学范围， 需要使用两个不同的染料浓度。在准备 RiboGreen 染料的工作液之前（见  下试剂准备） ，需要先决定是希望测定高宽度实验（High-range assay） （ 20ng/mL-500ng/mL RNA） ，还是低宽度实验（Low-range assay）（ 1ng/mL-50ng/mL RNA） ， 或两个范围都要检测。

三、RiboGreen 染料水溶性工作液的制备
3.   实验当天 ，在无菌的一次性聚丙烯塑料管内制备 RiboGreen 染料水溶性工作液。
4.   在 5 μL RiboGreen 染料中加入 1×TE 缓冲液至 2 mL，得到高宽度实验  的 RiboGreen 染料水溶性工作液；在 0.5 μL RiboGreen 染料中加入 1   ×TE 缓冲液至 2 mL，得到低宽度实验的 RiboGreen 染料水溶性工作液。 注意 ：制备好的 RiboGreen 染料水溶性工作液需避光保存 。最好在工作   液配制后数小时内用完 ，不要长期保存待用 。注意 ：避免使用玻璃器皿，因 RiboGreen 染料可能粘附到玻璃表面。

四、制备 RNA 标准曲线
    对于标准曲线，可以使用商业化的 RNA Standard ，比如：普遍使用 的 16S 和 23S 核糖体 RNA； 或其它纯化的 RNA 制品 。有的时候 ，推荐使用与待测定样本类似的 RNA 标准来建立标准曲线 。一般来说 ，绝大多数单链的 RNA 分子能产生几乎等同的荧光信号 。在核苷、 盐、尿素、 乙  醇、氯仿、去污剂、蛋白质和琼脂糖这些常见的污染核酸试剂的化合物存 在时，RiboGreen 染料的检测结果仍可维持良好的线性关系，即使荧光强 度可能会受到影响。为了确保达到有效的对照，用于制备标准曲线的 RNA溶液应该与待测样本保持一致 ，这样能保证含接近相似水平的杂质化合物。
5.   在塑料瓶中用 1×TE缓冲液配制浓度为 2 μg/mL RNA 溶液 。用比色杯在 1cm 长度通路下测量该 RNA 溶液在 260 nm (A260)下的基本吸光值，A260 ＝0.05 相当于 RNA 浓度 2 μg/mL。
6.   制作 High-range 标准曲线时 ，通过稀释 2 μg/mL RNA 溶液配制一系列 的 2×终浓度 RNA 标准溶液至一次性无核酸酶的塑料管中 ，最后转移到比色皿或培养板中。
7.   制作 Low-Range 标准曲线时 ，通过稀释 2 μg/mL RNA 溶液配制一系列 的 2×终浓度 RNA 标准溶液至一次性无核酸酶的塑料管中 ，最后转移到比色皿或培养板中。
8.   等体积混合 RiboGreen 染料工作液和 2×RNA 标准溶液 。于室温避光孵育 2-5min 。务必确保测量容器内加入了足够体积的测量液 ，对 10×10mm 比色皿来说 ，不能低于 2 mL；对 96 孔板的各孔来说 ，不要低于200 μL。
9.   选择使用荧光光度计或荧光酶标仪来测定样本荧光值 ，选择标准的荧光素波长（激发~480nm ，发射~520nm）。
10. 将每个样的荧光值减掉空白的荧光值 。之后使用校正好的荧光值为纵坐标 ，RNA 浓度为横坐标 ，来建立标准曲线。

五、样本分析
11. 用 1×TE缓冲液稀释样品到合适体积（比如： 1.0 mL 到 10×10 mm 比 色杯或 100 μL 到 96 孔微孔板） 。最好每个待测样本做不止一个稀释倍  数。待测样本稀释倍数越高，越有助于降低特定污染物的干扰作用。然而, 也要避免特别小的样本体积 ， 因为难以准确测量 。另外 ， 同一个实验中， 杂质水平尽量保持一致 ，要降低杂质引起的样品之间信号差异 。例如 ，如 果一系列 RNA 样品含盐浓度相差很大 ，那么它们就无法用一个简单的标准曲线来进行比较 。为了避免这样的问题 ，如果可能 ，调整所有样品中杂质浓度到相同水平。
12. 每个样品中加入等体积 RiboGreen 染料测量试剂 ，于室温避光孵育2-5min。
13. 选择与标准曲线测定时相同的仪器参数来测定样本荧光值 。为了降低光漂 白效应 ，所有样本的荧光测定时间保持不变 。将每个样的荧光值减掉空白 的荧光值。根据已经产生的 RNA 标准曲线来确定样本的 RNA 浓度。可能的话 ，通过做不同的样本稀释再重复测定 ，来验证定量结果。

六、样本中的 DNA 清除RiboGreen 染料也可以结合 DNA。可以先用无 RNA 酶的 DNA 酶来 去除样本中的 DNA ，从而避免由于 DNA 和 RiboGreen 染料结合产生的荧光干扰 ，确保样品中的荧光全部来自 RiboGreen 染料和 RNA 的结合。
14. 准备 10× DNase digestion buffer：无核酸酶的 200 mM Tris-HCl, pH7.5, 100 mM MgCl2 , 20 mM CaCl2。
15. 向每个含 DNA 样品中加 0. 11 倍体积的 10×DNase digestion buffer。例如，如果样品为 9 mL，就加入 1 mL 的 10×DNase digestion buffer。
16. 按照 1 μg DNA 添加~ 5 unit 的无 RNase 的 DNase I。
17. 37 °C 孵育 90min。
18. 用 1×TE缓冲液至少 10 倍稀释样品以降低消化液中残留盐离子对RiboGreen 染料测量产生干扰。
19. 按照上述步骤进行 RiboGreen 染料测定实验。

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