His 标记蛋白质微量纯化试剂盒
CAT#：JW-220542-20
常温运输，有 3 个低温成分

产品及特点    
基于组氨酸-镍（His-Ni）亲和层析的蛋白质纯化方法是目前分离纯化重组表 达蛋白质的重要方法 ，本产品就是专门用于上述实验的一站式产品 ，具有下列特点：
1.  一站式套装 ，含所需的镍柱介质、 上柱液、洗柱溶液和层析柱 ， 用户只需要提供表达 His 蛋白的细菌（酵母、杆状病毒、培养细胞） 即可 ， 非常方便。
2.  一次过柱即可获得纯度高达 95%的 His-标记蛋白。
3.  可在变性和非变性条件使用。
4.  每次可以处理 20 mL 的表达菌液 ，适合初步筛选和鉴定。
5.  提供 4 mL 浓度为 50%的 Ni-Agarose 介质 ，其最大载量为 20-30 mg His标记蛋白质/mL 介质 。本介质可以反复使用。
6.  本产品只能科研使用。

规格及成分    
本产品采用小扁盒盒包装

成份                                          编号            规格            包装材料
镍柱介质 ， 50%                    220542           4 mL           5 mL 本色瓶
1 M 咪唑溶液                          220542a         25 mL        30 mL 本色瓶
1 M Tris-HCl 溶液 ，pH7.9    220542b          25 mL         30 mL 本色瓶
5 M NaCl 溶液                      220542c           25 mL         30 mL 本色瓶
溶菌酶+核酸酶（3： 1： 1）  220542d          50 mg      1.5 mL 红盖管
盐酸胍干粉                               50-01- 1          6 g          10 mL 本色瓶
尿素干粉                                  57- 13-6          20 g          30 mL 本色瓶
PMSF 溶液（ 10mg/mL）      100833           0.5 mL       1.5 mL 白盖管
亲和层析柱 ， 6 mL                110809            1 套                塑料袋
使用手册                                 220542sc         1 份                   无

运输及保存
常温运输和保存 ，但镍柱介质长期需 4℃保存 ，溶菌酶+核酸酶和 PMSF 溶液需-20℃保存 ，有效期一年

自备试剂  
去离子水、 20%乙醇、针头过滤器（0.45μm）

使用方法  
1.  将镍柱介质充分混匀后 ，取适量加入到预放了一片筛板的层析柱中（镍柱介质用量需要根据 His 蛋白产量决定 ，其最大载量为 20-30 mg His 标记蛋白质/mL 介质 ，请根据实验需要取适量的镍柱介质加入层析柱）。
2.  用 5 倍柱体积（指镍柱介质的体积 ，下同） 自备去离子水洗柱 ，共三次。
3.  用 5 倍柱体积的新配结合液洗柱（配方如下 ， 以 10 mL 为例），共三次：
成分                                  用量              在结合缓冲液中的浓度
1 M Tri-HCl（pH7.9）      0.2 mL                      20 mM
1 M 咪唑溶液                   0. 1 mL                     10 mM
5 M NaCl 溶液                    1 mL                      500 mM
自备去离子水                    8.7 mL                        -
4.  室温 5000 g 离心 10 分钟收集 20 mL 表达菌液，弃上清，沉淀（约 100 mg）放冰上待用或放-80℃保存 。最好用不加诱导物的菌液做对照样。
5.  如果超声破碎细菌 ：加入 1 mL 冰浴的结合液（1 mL 菌液需要用 50 uL 结 合液），再加入 25 uL PMSF（ 10 mg/mL） 溶液 ，冰上超声裂解菌体直到 在显微镜下看见绝大多数细胞破裂 。超声参数需根据仪器型号自行摸索 ，但 裂解物必须不粘稠 ，否则会堵塞层析柱 。如果酶法裂解细菌 ：加入 1 mL 冰 浴的含溶菌酶的结合液（先取 20 mL 结合液 ，加入所有 50 mg 溶菌酶-核酸 酶干粉，溶解后分装成 1 mL/管，剩余的-20℃放置），再加入 25 uL PMSF（ 10 mg/mL）溶液 ，冰上放置 30 分钟。
6.  4 ℃下 13000- 15000 g 离心 10 分钟 ，去除残留细胞和细胞碎片以防堵柱 ， 收集上清 ， 留样做 SDS-PAGE 电泳对照 。如果要纯化裂解液中可溶部分的  His 标记蛋白，则直接进入第 7 步；如果要纯化裂解液中包涵体（沉淀部分）中的 His 标记蛋白 ，则直接进入第 12 步。
A、纯化细胞裂解液中可溶部分的 His 标记蛋白
7.  将上步得到的上清液上柱 ，让重力使裂解液自然流出 。如要提高 His 标记蛋 白与介质的结合效率 ，可用试剂盒提供的红盖将层析柱下的漏液口堵上 ，让细菌裂解液和介质在 4℃结合 30 分钟或过夜。
8.  用 10 倍柱体积结合液洗柱（配方见上表），收集并保存穿透液（含杂质或没被吸附的 His 标记蛋白 ，可做 SDS-PAGE 电泳的对照）。
9.  如果用一步式洗脱法（适合已经找到最佳咪唑浓度的情况），则直接用适量的 新鲜配制的洗脱液洗柱，收集并保存穿透液（含 His 标记蛋白）。洗脱液的配方如下（以 1 mL 体积和最佳咪唑浓度是 500 mM 为例）：
        成分                                  用量          在洗脱液中的浓度    
        1 M Tri-HCl  （ pH7.9）    20 uL            20 mM    
        1 M 咪唑溶液                   500 uL           500 mM    
        5 M NaCl 溶液                   100 uL         500 mM    
        自备去离子水                   380 uL              -    
10. 如果用多步式洗脱（适合不知道最佳咪唑浓度或一步式洗脱杂质多的情况）， 则按上表配制一系列咪唑浓度不同（如 40、60、100、200、300 和 500 mM）， 其他成分浓度不变的洗液 ，按从低到高的顺序洗涤并收集样品 ，SDS-PAGE电泳检测 His 标记蛋白所在的区域。
11. 洗脱后，依次使用 10 倍柱体积的去离子水洗涤柱子，再用 3 倍柱体积的 20% 乙醇平衡（乙醇要将填料浸没），最后堵住层析柱下端的漏口 ， 4 ℃保存待下次使用。
B、纯化包涵体中 His 标记蛋白
12. 将第 6 步离心得到的包涵体沉淀重悬于 1-3 mL 含盐酸胍结合液中或 1-3 mL 含尿素结合液中（建议优先使用尿素做变性剂 ， 因为得到的洗脱液可以直接 跑 SDS-PAGE ，而用盐酸胍的洗脱液需先除盐后才能电泳）。冰浴 1 小时以 使包涵体溶解，期间可轻柔摇晃几次。含变性剂的结合液配方如下（以 10 mL为例）：
成分                                  含盐酸胍结合液        含尿素结合液
1M Tri-HCl（pH 7.9）        200 uL                        200 uL
5M NaCl 溶液                       1 mL                          1 mL
盐酸胍（MW=95.6）            5.7 g                            无
尿素（MW=60. 1）                无                             4.8 g
自备去离子水                   加水到 10 mL            加水到 10 mL
13. 室温 10000×g 离心 20 分钟 ， 沉淀为未溶解的包涵体 。将上清（含溶解后的 His 标记蛋白） 以自备的针头过滤器（0.45 μm）过滤。
14. 将滤过液上柱 ， 后续纯化步骤同第 7-第 11 步 。只是所用结合液和洗脱液均含变性剂 ，含变性剂的洗脱液配方见下表（以 1 mL 为例）：
    成分                                  含盐酸胍洗脱液      含尿素洗脱液    
    1M Tri-HCl（pH7.9）                20 uL                     20 uL    
    1M 咪唑溶液                            500 uL                    500 uL    
    5M NaCl 溶液                           100 uL                   100 uL    
    盐酸胍（MW=95.6）               0.57 g                       无    
    尿素（MW=60. 1）                     无                       0.48 g    
    自备去离子水                           补水到 1 mL       补水到 1 mL    
注意事项    
整个实验需避免含巯基乙醇、 DTT 和 EDTA 等成分 。若洗脱液不能将 His 标记蛋白洗脱下来 ，可改用 pH 6.5- 4.5 的 pH 递减的 Tris-HCl 洗脱。