【测定原理】
本试剂盒采用间接竞争ELISA方法检测牛奶和水产等样本中的三聚氰胺，在微孔条上预包被上偶联抗原，利用抗原与抗体的特异性免疫化学反应的原理来进行，样本中的三聚氰胺和微孔条上预包被偶联抗原竞争抗三聚氰胺抗体，加入酶标记物后，用TMB底物显色，样品中的三聚氰胺含量与样品的吸光度值呈反比，与标准曲线比较即可得出三聚氰胺含量。
【试剂盒技术指标】
规 格：96孔/盒
灵 敏 度： 1ppb
检测时间： 45min
样本检测下限：
奶 粉………………………………………………20 ppb
牛 奶………………………………………………16 ppb
牛 奶/奶 粉（处理法二）……………………… 1 ppb
组织（鸡/猪/鸭/鱼/虾/肝脏）……………………2 ppb
饲 料 …………………………………………100 ppb
蛋 类 …………………………………………20 ppb
血 清 ………………………………………… 4 ppb
交叉反应率
三聚氰胺 …………………………………………100%
三聚氰酸……………………………………………60%
三 嗪 ……………………………………………< 1%
三嗪二铵…………………………………………< 1%
回收率
牛 奶/奶 粉 ……………………………………90±15%
组 织 …………………………… 85±10%
饲 料 …………………………… 85±10%
蛋 类 …………………………… 80±10%
【试剂盒组成】
1、 微量测试孔：1×96孔板（12条×8孔）
2、 标准液X6瓶：（1ml/瓶）0ppb、1ppb、3ppb、9ppb、27ppb、81ppb
3、 高浓度标准品：×1瓶：（1ml/瓶） 1ppm
4、 酶标记物 7ml………………… 红色帽
5、 抗体工作液 7ml………………… 绿色帽
6、 底物A液 7 ml………………… 棕色帽
7、 底物B液 7 ml …………………黑色帽
8、 终止液 7 ml …………………黄色帽
9、 20X浓缩洗涤液40 ml……………白色帽
10、 2X浓缩复溶液 50 ml ……………蓝色帽
【所用仪器、试剂】
具备的仪器：微孔板、酶标仪、匀质器、振荡器、离心机、刻度移液管、天平（感量0.01g）
微量移液器：单道 20ul～200ul、100ul～1000ul
多道 250 ul
试 剂： 乙腈 、氢氧化钠 、浓盐酸、去离子水、正己烷、甲醇
【实验前溶液配制】
配液1、将2X浓缩复溶液用去离子水按照1：1稀释
（1 份浓缩复溶液+1份去离子水）用于样本的复溶。
配液2、将40ml浓缩洗涤液（20倍浓缩）用去离子水按照1：19稀释（1份浓缩洗涤液+19份去离子水），或按 所需用量配制洗涤液。
配液3 1M HCl 溶液
取8.6ml浓HCl加去离子水定容至100ml。
配液4 1M NaOH 溶液
称取4g NaOH加去离子水定容至100ml。
配液5 0.1M NaOH 溶液
称取0.4g NaOH加去离子水定容100ml。
配液6 乙腈-0.1M NaOH溶液
84ml乙腈和16ml 0.1M NaOH混合均匀。
【样本前处理步骤】
样本处理前须知
处理任何样本时，都必须注意：
（a）本试剂盒所检测的组织样本包括：动物组织、禽类和水产组织。eg:鸡、鸭、猪、牛、羊、兔、鱼、虾等。
（b）实验中必须使用一次性吸头，在吸取不同的试剂时要更换吸头。
（c）实验之前须检查各种实验器具是否干净，
必要时可对实验器具进行清洁，以避免污染干扰实验结果。
样本处理方法
（a）牛奶专用样本处理方法：
1、 取牛奶样本600µl到2ml的离心管中，加入1ml乙腈，充分振荡混匀；4000r/min以上离心5min；
2、 取100µl上清液，再加入500µl复溶液(见配液1)，混匀；
3、 取50µl用于分析。
样本稀释倍数:16倍
（b）奶粉；奶酪专用样本处理方法：
1、称取2.0±0.05g奶粉样本至50ml离心管中，加入4ml甲醇，充分振荡；
2、15℃4000r/min以上离心10min，取100µl上清液，再加入900µl复溶液(见配液1)，混匀；取50µl用于分析。
样本稀释倍数:20倍
（c）饲料样品处理方法：
1、将饲料样品研碎，称2.0±0.05g研碎的饲料样品，加入2ml 1M HCl，加入16ml去离子水均质。
2、旋流1min，放振荡器上振荡2min15℃4000r/min以 上离心15min，取出10ml上清液并用1M NaOH将 pH值调至6-8。（注：因饲料样品的不同，加入1M NaOH的量有所差异，根据情况调节，一般加入范围是0.5ml—1ml之间）。
3、15℃，4000r/min以上离心15min，吸出上清液。 （如果上清仍然浑浊可提高转速或用滤纸过滤）。
4、用稀释后的复溶液10倍稀释上清液（取100µl上清液加入900µl稀释后的复溶液，并且混合均匀，混合30s）。
5、取50µl进行分析
样本稀释倍数:100倍
（d）牛奶/奶粉样本处理方法（处理法二）：
1、取2ml奶样或2g奶粉至离心管中；加入8ml乙腈-0.1M NaOH充分振荡2min，15℃ 4000r/min以上离心10min，取4ml上清液在56℃条件下氮气或空气流吹至完全干燥；
2、用1ml正己烷溶解干燥的残留物后，再加入1ml稀释后的复溶液混合30s，离心去除上层正己烷相；
3、取50µl用于分析。
样本稀释倍数：1倍 定量下限定为：2ppb
（e）组织（鸡/猪/鸭/鱼/虾/肝脏）样本处理方法：
1、取2.0±0.05g均匀组织样本于50ml离心管中；
加入8ml乙腈-0.1M NaOH充分振荡2min，15℃ 4000r/min以上离心10min，取2ml上清液在56℃条件下氮气或空气流吹至完全干燥；
2、 用1ml正己烷溶解干燥的残留物后，再加入1ml稀释后的复溶液混合30s，离心去除上层正己烷相；
3、 取50µl用于分析。
样本稀释倍数：2 倍
（f）蛋类样本处理方法：
1、用均质器低速均匀样本（蛋清、蛋黄或全蛋）
称取2.0±0.05g均质过的样本，加入8ml乙腈-0.1M NaOH充分振荡2min；（注：蛋清含蛋白成份高，加入提取液后会形成一团胶状物，较蛋黄或全蛋难易摇匀，此情况为正常现象不影响实验结果）
15℃， 4000r/min以上离心10min，取1ml上清液在56℃条件下氮气或空气流吹至完全干燥；
2、 用1ml正己烷溶解干燥的残留物后，再加入1ml稀释后的复溶液混合30s，离心去除上层正己烷相；
3、 取下层相用稀释好的复溶液按1：3 （50µl样本液加150µl稀释后的复溶液）稀释，混合30s；
4、 取50µl用于分析。
样本稀释倍数：20倍
（g）血清样本处理方法：
1、取0.5ml血清样本于50ml离心管中；
2、加入2ml乙腈-0.1M NaOH充分振荡2min，15℃ 4000r/min以上离心10min，取1ml上清液在56℃条件下氮气或空气流吹至完全干燥；
3、用1ml正己烷溶解干燥的残留物后，再加入1ml稀释后的复溶液混合30s，离心去除上层正己烷相；
4、取50µl用于分析。
样本稀释倍数：4 倍
【酶标免疫分析程序】
操作步骤：
1、将所需试剂从冷藏环境中取出，置室温（20-25℃）平衡30min以上，注意每种液体试剂使用前均须摇匀。
2、按板架及需要取出微孔条，将不用的微孔放入自封袋，保存于2-8℃。
3、编号：将样本和标准品对应微孔按序编号每个样本和标准品做2孔平行，并记录标准孔和样本孔所在的位置。
4、加标准品/样本50µl /孔，然后加酶标记物50μl/孔，再加入抗体工作液50µl/孔。轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板，25℃环境反应30min。
5、取出用洗涤液按每孔250μl洗板4-5次，每次浸泡15-30秒，拍干（拍干后未被清除的气泡可用干净的枪头刺破）
6、显色：每孔加入底物液A液50µl再加B液50µl，轻轻振荡混匀，25℃环境避光显色15min。
7、测定：每孔加入终止液50µl，轻轻振荡混匀，设定酶标仪于450nm处（建议用双波长450/630nm检测在5min内读完数据），测定吸光度值（OD值）。
【结果判定】
结果判定有两种方法，粗略判定可用第1种方法，定量判定用第2种方法。注意样本吸光值与三聚氰胺的含量成负相关。
1、粗略判定：
用样本的平均吸光度值与标准值比较即可得出其浓度范围(ng/ml)。假设样本1的吸光度值为0.3，样本2的吸光度值为1.0，标准液吸光度值分别是：0ppb为2.243； 1ppb为1.816；3ppb为1.415；9ppb为0.74；27ppb为0.313；81ppb为0.155。则样本1的浓度范围是27ppb-81ppb; 样本2的浓度范围是3ppb-9ppb，乘以其对应的稀释倍数即为样本中三聚氰胺实际浓度。
2、定量判定：
所获得的每个浓度标准溶液和样本吸光度值的平均值（B）除以第一个标准（0标准）的吸光度值（B0）再乘以100%，即百分吸光度值。
| 百分吸光度值（%）＝ | B | ×100% |
| B0 |
B—标准溶液或样本溶液的平均吸光度值
B0—0ng/ml标准溶液的平均吸光度值
以标准品百分吸光率为纵坐标，以三聚氰胺标准品浓度（ng/ml）的半对数为横坐标，绘制标准曲线图。将样本的百分吸光率代入标准曲线中，从标准曲线上读出样本所对应的浓度，乘以其对应的稀释倍数即为样本中三聚氰胺实际浓度。
若利用试剂盒专业分析软件进行计算，更便于大
量样品的准确、快速分析。
3、标准准曲线：
4、再现性：
由多个不同的实验结果确定了精密度，图2显示出三聚氰胺检测试剂盒的精密度情况，获得的标准吸收值的变异系数（%CV）对相应三聚氰胺浓度作曲线，可以看到在全部范围内变异系数如此之低，可以得到很好的再现性。
【注意事项】
1、 使用前将所有试剂温度回升至室温20-25℃。试剂及标本没有回到室温（20-25℃）会导致所有标准的OD值偏低。
2、 在洗板过程中如果出现板孔干燥的情况，则会伴随着出现标准曲线不成线性，重复性不好的现象。所以洗板拍干后应立即进行下一步操作。
3、 混合要均匀，否则会出现重复性不好的现象。
4、 反应终止液为2M硫酸，避免接触皮肤。
5、 不要使用过了有效日期的试剂盒，稀释或搀杂使用会引起灵敏度、OD值的变化。不要交换使用不同批号的盒中试剂。
6、 不用的微孔板放进自封袋密封；标准物质和无色的发色剂对光敏感，因此要避免直接暴露在光线下。
7、 显色液若有任何颜色表明变质，应当弃之。0标准的吸光度值小于0.5个单位（A450nm< 0.5 ）时，表示试剂可能变质。
8、 该试剂盒最佳反应温度为25℃，温度过高或过低将导致检测吸光度值和灵敏度发生变化。
【储存】
原包装应储存于2～8℃保鲜冷藏，切勿冷冻。
【有效期】
有效期12个月;生产日期、有效期、生产批号见外包装。
