主要用途
细胞硬脂酰辅酶A去饱和酶(STEAROYL COA DESATURASE)活性光谱法定量检测试剂是一种旨在通过底物硬脂酰辅酶A诱导还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸所还原的细胞色素b5的再氧化后吸光峰值的降低,即采用光谱法定量测定样品中酶活性的权威而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。其适用于各种原代细胞裂解萃取液样品(动物、人体)、纯化微粒体样品硬脂酰辅酶A去饱和酶的活性检测,以及抑制剂筛选。产品严格无菌,即到即用,操作简捷,性能稳定。
技术背景
硬脂酰辅酶A去饱和酶(stearoyl CoA desaturase;SCD;EC1.14.19.1),又称为Δ9去饱和酶(delta-9 desaturase),是四类去饱和酶(Δ9、Δ6、Δ5、Δ4)之一,一种内质网整合性膜蛋白,参与内源性或外源性脂肪酸代谢的关键酶之一。通过限速催化氧化反应,在9号位上引入双键,由饱和脂肪酸底物,例如棕榈酸辅酶A(palmitoyl CoA)和硬脂酸辅酶A(stearoyl CoA),生物合成不饱和单脂肪酸,例如棕榈油酸辅酶A(palmitoleoyl CoA)和油酸辅酶A(oleoyl CoA),后者成为甘油三脂、胆固醇酯、磷脂、腊酯等脂类生物合成的底物,调节信号传导和细胞分化。哺乳动物的硬脂酰辅酶A去饱和酶分成5种亚酶:其中小鼠4种(SCD1至SCD4)、大鼠2种(SCD1、SCD2)、人体2种(SCD1和SCD5)已经克隆证实。人体SCD1存在于大多数组织,而SCD5主要分布在脑组织和胰腺组织中。人体SCD1的活性与血清甘油三脂、极低密度脂蛋白(VLDL)水平直接相关,同时影响血清高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL)、总胆固醇水平,以及胆固醇转运、不饱和单脂肪酸的分泌和产生、细胞分化、胰岛素敏感性等。硬脂酰辅酶A去饱和酶成为药物靶标,用于治疗心血管疾病和肥胖症等。基于氧化型细胞色素b5(oxidized cytochrome b5),在还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(reduced nicotinamide adenine dinucleotide;NADH)的存在下,受到内源性细胞色素b5还原酶的催化,转化为还原型细胞色素b5(reduced cytochrome b5),进而底物硬脂酰辅酶A,在硬脂酰辅酶A去饱和酶的催化下,转化为油酸辅酶A,同时还原型细胞色素b5再次被氧化(reoxidation)为氧化型细胞色素b5,在分光光度仪下,出现吸光值的变化(424nm 波长),来定量测定硬脂酰辅酶A去饱和酶的活性。其反应系统为:
产品内容
清理液(Reagent A) 毫升
裂解液(Reagent B) 毫升
缓冲液(Reagent C) 毫升
反应液(Reagent D) 微升
底物液(Reagent E) 微升
阴性液(Reagent F) 毫升
产品说明书 1份
保存方式
保存清理液(Reagent A)在4℃冰箱里,其余的保存在-20℃冰箱里;有效保证6月
用户自备
1.5毫升离心管:用于样品操作的容器
15毫升锥形离心管:用于样品操作的容器
细胞刮脱棒:用于细胞脱离
DOUNCE匀浆器:用于裂解细胞
4℃(微型)台式离心机:用于样品处理
4℃超速离心机:用于样品处理
恒温水槽或培养箱:用于样品反应孵育
比色皿或96孔板:用于光谱分析的容器
分光光度仪或酶标仪:用于光谱分析
实验步骤
一、 样品准备
1.准备好25cm2细胞培养瓶或60mm细胞培养皿的待测培养细胞(1至5 X 106细胞)
2. 小心加入xx毫升清理液(Reagent A),覆盖生长表面
3. 小心抽去清理液
4. 使用细胞刮脱棒轻柔刮脱细胞(注意:可以使用胰酶消化)
5. 加入xx毫升清理液(Reagent A),混匀细胞
6. 移入到预冷的15毫升锥形离心管(注意:悬浮细胞从这一步骤开始)
7. 放进4℃台式离心机离心5分钟,速度为300g
8. 小心抽去上清液
9. 加入xx微升裂解液(Reagent B),充分混匀
10. 转移到预冷的1.5毫升离心管
11. 涡旋震荡5秒,充分混匀
12. 即刻放进预冷的DOUNCE匀浆器
13. 在冰槽里用研磨棒匀化组织(约80下)
14. 将所有细胞匀浆物移入15毫升锥形离心管
15. 放进4℃台式离心机离心5分钟,速度为10000g
16. 小心移取500微升上清液到新的预冷的1.5毫升离心管——此为总蛋白样品
17. 放进4℃超速离心机离心60分钟,速度为100000g
18. 小心抽去上清液
19. 加入xx微升裂解液(Reagent B),混匀颗粒群——此为微粒体样品
20. 移取10微升进行蛋白定量检测(注意:建议使用 Bradford蛋白质浓度定量试剂盒-G&VS30030.1)
21. 即刻放进-70℃保存或置于冰槽里继续后续操作
二、 测读准备
1. 准备好待测样品,置于冰槽里融化
2. 设定好分光光度仪或酶标仪:温度25℃,波长424nm,间隔30秒,测读7次(共3分钟),并置零
3. 缓冲液(Reagent C)室温下均衡温度
三、 样品背景对照测定
1. 移取xx微升缓冲液(Reagent C)到新的200微升比色皿
2. 加入20微升待测样品(注意:建议总量200微克微粒体蛋白)
3. 加入xx微升反应液(Reagent D)
4. 在25℃温度下孵育5分钟
5. 加入xx微升阴性液(Reagent F)
6. 上下倾倒数次,混匀(限定在3秒之内)
7. 即刻放进分光光度仪检测,此为样品背景空对照(注意:参见注意事项10)
四、 样品活性测定
1. 移取xx微升缓冲液(Reagent C)到新的200微升比色皿
2. 加入20微升待测样品(注意:建议总量200微克微粒体蛋白)
3. 加入xx微升反应液(Reagent D)
4. 在25℃温度下孵育5分钟
5. 加入xx微升底物液(Reagent E)
6. 上下倾倒数次,混匀(限定在3秒之内)
7. 即刻放进分光光度仪检测,此为样品活性读数(注意:参见注意事项10)
五、 计算样品活性
六、酶标板测定
1. 在96孔板上做好相应标记:样品背景对照和待测样品活性
2. 分别移取xx微升缓冲液(Reagent C)到96孔板中的所有孔里
3. 分别加入20微升待测样品(注意:建议总量200微克微粒体蛋白)到所有孔里
4. 分别加入xx微升反应液(Reagent D)到所有孔里
5. 轻轻摇动96孔酶标板
6. 在25℃温度下孵育5分钟
7. 加入xx微升阴性液(Reagent F)到样品背景对照孔里
8. 加入xx微升底物液(Reagent E)到待测样品活性孔里
9. 轻轻摇动酶标板(限定在3秒之内)
10. 即刻放进酶标仪检测:获得吸光读数(注意:参见注意事项10)
11. 活性计算:
注意事项
1. 本产品为20次操作
2. 操作时,须戴手套
3. 样品忌用DTT和巯基乙醇等处理
4. 样品背景和样品活性需平行检测
5. 比色测定后,比色皿须清洗彻底
6. 反应物混合后3秒内进行光谱测定
7. 光谱测定后,比色皿须清洗彻底
8. 通常背景空对照的吸光读数会呈现降低,表明样品中含有细胞色素b5还原酶的干扰以及细胞色素b5的自发氧化
9. 样品0分钟读数通常和背景空对照0分钟读数理论上一致
10. 样本测定3分钟读数低于0分钟读数表明具有酶活性
11. 建议选择样品读数开始下降后的1分钟OD值作为活性读数(initial rate),同时选择平行时间的背景OD值作为背景对照读数
12. 如果酶活性过低,可以延长反应时间
13. 建议待测样本为微粒体,其蛋白浓度为100微克/10微升 (本公司提供 Bradford蛋白质浓度定量试剂盒G&VS30030.1)
14. 如果待测样品浓度过高或过低,可以调整样品浓度
15. 硬脂酰辅酶A去饱和酶活性单位浓度定义:在25℃室温下,pH 8.0的情况下,每单位酶在单位时间内(每分钟)再氧化1微摩尔的细胞色素b5
16. 本公司提供系列酶学检测试剂产品
质量标准
1. 本产品经鉴定性能稳定
2. 本产品经鉴定检测敏感
使用承诺
上海极威生物科技有限公司秉着“信誉至上、客户满意、质量承诺”的宗旨为我们的用户提供优质产品和服务。用户收到货后,应按照产品说明书上的规定妥善保管并在有效期内使用。我们的产品在销售前已作严格的质量鉴定,保证说明书所述的使用效果。在货到后10天内若发现确属本产品的质量问题,请立即以书面形式(实验报告)与本公司联系,并将该产品退回,经检验确系产品质量所致,本公司负责更换产品。如系使用者错误操作所致,本公司不承担由此造成的损失。
友情提醒
IF IT DOESN’T WORK, RECHECK YOUR EXPERIMENT TO SEE WHAT YOU DID WRONG。
订购信息
单组分订购信息
编号 名称 规格
G&VS50610.1 细胞硬脂酰辅酶A去饱和酶活性高效液相色谱比色法定量检测试剂盒 20次
G&VS50610.1A 清理液(Reagent A) 毫升
G&VS50610.1B 裂解液(Reagent B) 毫升
G&VS50610.1C 缓冲液(Reagent C) 毫升
G&VS50610.1D 反应液(Reagent D) 毫升
G&VS50610.1E 底物液(Reagent E) 毫升
G&VS50610.1F 阴性液(Reagent F) 毫升
试剂盒订购信息
产品编号 | 名称 | 规格 |
G&VS50492.1 | 细胞硬脂酰辅酶A去饱和酶(STEAROYL COA DESATURASE)活性 高效液相色谱(HPLC)比色法定量检测试剂盒 | 20次 |
G&VS50492.2 | 组织硬脂酰辅酶A去饱和酶(STEAROYL COA DEHYDROGENASE)活性 高效液相色谱(HPLC)比色法定量检测试剂盒 | 20次 |
G&VS50493.1 | 细胞硬脂酰辅酶A去饱和酶(STEAROYL COA DESATURASE)活性 薄层色谱(TLC)同位素法定量检测试剂盒 | 20次 |
G&VS50493.2 | 组织硬脂酰辅酶A去饱和酶(STEAROYL COA DEHYDROGENASE)活性 薄层色谱(TLC)同位素法定量检测试剂盒 | 20次 |
G&VS50610.1 | 细胞硬脂酰辅酶A去饱和酶(STEAROYL COA DESATURASE)活性光谱法定量检测试剂盒 | 20次 |
G&VS50610.2 | 组织硬脂酰辅酶A去饱和酶(STEAROYL COA DEHYDROGENASE)活性 光谱法定量检测试剂盒 | 20次 |