GST标记蛋白质微量纯化试剂盒

原理及特点

重组蛋白N端的GST谷胱甘肽S转移酶（Glutathione S Transferase）能提高重组蛋白的水溶性，所以常用于蛋白质重组表达。GST-谷胱甘肽亲和层析是利用GST标记的蛋白能与谷胱甘肽层析介质结合，并能被还原型谷胱甘肽洗脱的特点而建立，是目前分离纯化GST标记蛋白质的重要方法。本产品就是专门用于上述目的，具有下列特点：

1. 一站式套装，含所需的谷胱甘肽介质、溶液和层析柱，用户只需要提供表达GST标记蛋白的细菌（酵母、杆状病毒、培养细胞）即可，非常方便。

2. 专一性强，一次过柱即可获得纯度高达95%的GST-标记蛋白。

3. 只能在非变性条件下使用，只可用于纯化没形成包涵体的GST标记蛋白。

4. 每次可以处理20 mL的表达菌液，适合初步筛选和鉴定。

5. 提供4 mL 浓度为50%的谷胱甘肽-Agarose介质，可吸附5-10 mg GST标记蛋白质。

本介质可以反复使用多次。

规格及成分

运输及保存

常温运输和保存，谷胱甘肽-琼脂糖介质需常温运输4℃保存，溶菌酶、Benzonase和PMSF需低温运输，-20℃保存。有效期一年

自备试剂

超纯水

使用方法

一:重组蛋白的表达和细菌收集

1. 37℃振荡培养20 mL含表达质粒的细菌到OD600=0.6-0.8。

2. 加IPTG到终浓度为0.1 mM，30℃振荡培养3小时或22℃振荡培养8小时（或过夜）。

3. 4℃ 5000 g离心10分钟收集20 mL表达菌液，弃上清。

4. 用1×PBS缓冲液重悬细菌沉淀，4℃ 5000 g离心10分钟，弃上清。沉淀可直接用于裂解或放-80℃保存。1×PBS缓冲液可用自备的超纯水稀释本试剂盒提供的10×PBS缓冲液而得。PBS缓冲液极其容易长细菌，注意防止污染。

二：细胞裂解

5. 如果用超声波破碎细胞，先用1 mL冰浴的新鲜配制的细胞裂解液重悬细菌沉淀（细胞裂解液的配制方法：在1 mL 1×PBS缓冲液中加入50 uL溶液A和 50 uL 10 mg/mL的PMSF溶液，混匀即可）。冰上超声裂解重悬菌体直到在显微镜下看见绝大多数细胞破裂。超声参数需根据仪器型号自行摸索，一般选1K-10K频率处理15次，每次20秒，间隔1分钟（必需放置在冰上）。裂解物不能粘稠，否则会堵塞层析柱。

6. 如果用酶法破裂细胞，则在1 mL冰浴的、新鲜配制的细胞裂解液重悬细菌（细胞裂解液配制方法：在1 mL 1×PBS缓冲液中加入1.5 mg溶菌酶干粉、50 uL 10 mg/mL的PMSF溶液和5 uL Benzonase溶液，混匀即可）。将重悬细菌冰上放置30分钟，得到细菌裂解物。

7. 将超声或酶法得到的细胞裂解物在13000 g 4℃离心10分钟去除未裂解细胞和裂解细胞碎片以防堵柱，所得上清即含可溶性GST标记蛋白。预留少量（如100uL）作为裂解液留样，其余用于第10步的过柱。

三：层析柱的制备和GST蛋白纯化

8. 摇晃将4mL谷胱甘肽-琼脂糖介质充分混匀后，全部加入到预放了一片筛板的层析柱中（介质的最低用量需要根据GST蛋白产量决定，100 mL菌液最少需要使用200 uL介质。此处加2mL则绰绰有余）。下列步骤各溶液的用量均针对4mL介质而定，如果介质用量不同，各溶液用量需相应调整。

9. 用40 mL 预冷的1×PBS缓冲液洗柱。

10. 将第7步得到的上清液（含可溶性GST标记蛋白）上柱，让重力使上柱液自然流出，收集并保存穿透液用于SDS-PAGE电泳。GST和谷胱甘肽之间的结合很缓慢，所以流速一定不能快，否则结合不充分。流速一般在0.2-1 mL/分钟即可。如要提高GST标记蛋白与介质的结合效率，可用本试剂盒提供的红盖将层析柱下的漏液口堵上，让细菌裂解液和介质在4℃结合30分钟或过夜。也可以将穿透液反复上柱。

11. 用10 mL 1×PBS缓冲液洗柱，收集并保存穿透液（含杂蛋白）并预留100uL作为穿透液留样，其余在确认实验成功后再丢弃。

12. 用0.2-0.5 mL GST洗脱液洗柱，收集并保存穿透液，此穿透液即纯化的GST标记蛋白样品。GST洗脱液的配制方法是将约80mg GST洗脱液成分二干粉全部加入到GST洗脱液成分一溶液中，摇晃直到干粉全部溶解即得GST洗脱液，分装成小份放-20℃保存，每次用一管。由于它可能含蛋白酶污染，所以纯化样品不能在4℃长期放置，需留100uL左右用于后续浓度测定或/和SDS-PAGE电泳，其余放-80℃长期放置。

13. 用裂解液留样（第7步）、穿透液留样（第11步）和纯化样品留样（第12步）进行蛋白定量或/和SDS-PAGE分析。注意：本操作没有预先脱盐，故只能用Bradford法或OD检测法测定裂解液留样、穿透液留样和样品留样的蛋白浓度。按OD检测法，1 OD280约等于0.5 mg/mL蛋白。由于GST的分子量为26 KD，所以在SDS-PAGE胶上，GST标记蛋白将比天然蛋白大26 KD。

附：GST柱的恢复（本试剂盒不含所需试剂）

1. 用3倍介质体积的6 M盐酸胍处理柱子10分钟。介质为2mL则用6mL，下同。

2. 用3倍介质体积的超纯水处理柱子10分钟。

3. 用3倍介质体积的缓冲液一（0.5 M NaCl，0.1 M TrisHCl，pH 8.5）处理柱子10分钟。

4. 用3倍介质体积的缓冲液二（0.5 M NaCl，0.1 M TrisHCl，pH 4.5）处理柱子10分钟。

5. 再重复3-4步两次。

6. 用3倍介质体积的超纯水处理柱子3次。

7. 若需要立即使用，则用3倍介质体积的1×PBS缓冲液处理柱子2次。堵上漏口，加3倍介质体积的1×PBS缓冲液洗涤后立即使用。

若长时间不用，则上步的1×PBS改成20%的乙醇，其余操作完全相同。

疑难解答

Q：为何GST蛋白不与介质结合或结合很弱？

A：可能原因及解决办法：标签蛋白变性（使用温和裂解方法）、标签蛋白聚集（补加DTT）、标记蛋白浓度太低（浓缩样品）、标记蛋白改变了GST的构型（降低结合时的温度）、结合时间太短（延长蛋白与吸附柱的结合时间）。

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