【原理】

本试剂盒采用间接竞争ELISA方法，在微孔条上预包被偶联抗原，样本中的残留物林可霉素与微孔条上预包被的偶联抗原竞争其抗体，加入酶标记物后，用TMB底物显色，样本吸光值与其所含苏丹林可的含量成负相关，与标准曲线比较即可得出残留物林可霉素的含量。

【适用范围】

      适用于检测动物组织（肌肉、肝脏、鸡肉、水产）蜂蜜、牛奶等样本中林可霉素类药物的残留量。

【试剂盒技术指标】   

规      格：96孔/盒

灵 敏 度： 0.1ppb

检测时间： 75 min

样本检测下限：

组织…………………………………………… 2ppb

蜂蜜…………………………………………… 2ppb

牛奶 ……………………………………………2ppb

样本回收率

组织……………………………………80% ±10%

蜂蜜……………………………………80% ±10%

牛奶 ……………………………………85% ±10%

交叉反应率

林可霉素……………………………………100%

卡娜霉素……………………………………0.1%

链霉素………………………………………0.1%

【试剂盒组成】  

 1、微量测试孔：每条8孔，一板12条

2、标准液×6瓶：（1ml/瓶）0ppb、0.1 ppb、 0.3 ppb、

     0.9ppb、2.7ppb、8.1 ppb

3、高浓度标准品：×1瓶：（1ml/瓶）100ppb

4、酶标记物      12ml………………………………红色帽

5、抗体工作液    7ml………………………………绿色帽

6、底物液 A液   7ml………………………………棕色帽

7、底物液 B液   7ml……………………………… 黑色帽

8、终 止 液         7ml……………………………… 黄色帽

9、20X浓缩洗涤液  40ml…………………………白色帽

10、2X浓缩复溶液   50ml…………………………蓝色帽

【所用仪器、试剂】   

仪          器：微孔板酶标仪450nm/630nm、旋转蒸发仪/

                     氮气吹干装置、均质器、振荡器、离心机、

                     刻度移液管、天平（感量0.01g ）

微量移液器：单道 20µl～200µl、100µl～1000µl、多道 250µl

试           剂：甲醇、盐酸

【实验前溶液配制】

配液1: 0.015M盐酸溶液             

         量取1.25ml浓盐酸加入到盛有去离子水的容器中定容至1L。

配液2: 甲醇－0.015M盐酸溶液

         量取10ml甲醇和60ml 0.015M 盐酸溶液混合均匀。

配液3、将2X浓缩复溶液用去离子水按照1：1稀释（1 份浓缩复溶

               液+1份去离子水）用于样本的稀释。

配液4、将40ml浓缩洗涤液（20倍浓缩）用去离子水按照1：19稀释

        （1份浓缩洗涤液+19份去离子水），或按所需用量配制洗涤液。

【样本前处理步骤】   

处理任何样本时，都必须注意：

（a）实验中必须使用一次性吸头，在吸取不同的试剂时要更换吸头。

（b）实验之前须检查实验器具是否干净，必要时可对实验器具进行清洁，以避免污染干扰实验结果。

u 样本处理方法：

（A）水产、禽类、猪、牛、羊等动物组织（样本稀释倍数20）

1、用均质器均质组织样本；

2、称取2.0±0.05g均质物至50ml聚苯乙烯离心管中，加入4ml甲醇－0.015M盐酸溶液，用振荡器振荡5min；

3、4000转/分以上，室温（20-25℃）离心5min；

4、移取50μl上清液，加入450μl复溶工作液充分混匀；

5、取50μl用于分析。

（B）蜂蜜、蜂王浆（样本稀释倍数20）

1、称取2.0±0.05g蜂蜜至50ml聚苯乙烯离心管中，加入4ml去离子水，将蜂蜜全部溶解，置振荡器中振荡3min；

2、4000转/分以上，室温（20-25℃）离心5min；

3、取上层清液50 μl，加入450μl复溶工作液，充分混匀；

4、取50μl用于分析。

（C）牛奶样品处理方法（样本稀释倍数20）

1、称取2.0±0.05g奶粉样本至50ml离心管中，加入4ml甲醇，充分振荡，室温4000转/分以上，室温（20-25℃）离心5分钟。

2、取50µl上清液，再加入450µl复溶工作液，充分混匀；

3、取50µl用于分析。

【酶标免疫分析程序】   

操作步骤：

1、 从4℃冷藏环境中取出所需试剂，置室 温（20-25℃）平衡30min以上，注意每种液体试剂使用前均须摇匀。

2、 取出框架及需要数量的微孔，将不用的微孔放入自封袋，保存于2-8℃。

3、 编号：将样本和标准品对应微孔按序编号，每个样本和标准品做2孔平行，并记录标准孔和样本孔所在的位置。

4、 加标准品或样本50µl/孔到各自的微孔中，然后加抗体50µl/孔，用盖板膜封板，轻轻振荡混匀。25℃环境中反应30min。

5、 取出将孔内液体甩干，用洗液250µl /孔，洗板4－5次，每次间隔15-30s，用吸水纸拍干（拍干后未被清除的气泡可用干净的枪头刺破）。

6、 每孔加入酶标记物100µl，盖板膜盖板后置25℃环境中反应30min。重复步骤5。

7、 显色：每孔加入底物液A液50µl， 再加B液50µl，轻轻振荡混匀，25℃环境中避光显色15min。

8、 测定：每孔加入终止液50µl，轻轻振荡混匀，设定酶标仪于450nm处（建议用双波长450/630nm检测，在5min内读完数据），测定每孔OD值。

【结果判定】   

结果判定有两种方法，粗略判定可用第1种方法，定量判定用第2种方法。注意样本吸光值与其所含林可霉素成负相关。