【原理】

本试剂盒采用间接竞争ELISA方法，在微孔条上预包被庆大霉素偶联抗原，样本中的残留物庆大霉素和微孔条上预包被的庆大霉素偶联抗原竞争庆大霉素抗体，加入酶标记物后，用TMB底物显色，样本吸光值与其所含残留物庆大霉素的含量成负相关，与标准曲线比较可得出相应残留物庆大霉素的含量。

【试剂盒技术指标】   

规       格：96孔/盒

灵 敏 度： 0.1ppb

检测时间： 75min

样本定量检测下限

组织(猪肉/肝 鸡肉/肝 /水产）………………………6ppb

蜂蜜 …………………………………………………6ppb

牛奶 …………………………………………………6ppb

细胞培养液…………………………………………………12ppb

交叉反应率

庆大霉素……………………………………………100%

链霉素……………………………………………  <0.1%

新霉素…………………………………………… <0.1%

样本回收率

组  织……………………………………………85±10%

蜂蜜 ……………………………………………85±10%

牛奶 …………………………………………85±10%

细胞培养液…………………………………………85±10%

【试剂盒组成】   

1、微量测试孔：每条8孔，一板12条

2、标准液×6瓶：（1ml/瓶）0ppb、0.1 ppb、 0.3 ppb、

0.9ppb、2.7ppb、8.1 ppb

3、高浓度标准液×1瓶：（1ml/瓶）：100ppb

4、酶标记物      12ml………………………………红色帽

5、抗体工作液    7ml………………………………绿色帽

6、底物液 A液   7ml………………………………棕色帽

7、底物液 B液   7ml……………………………… 黑色帽

8、终 止 液         7ml……………………………… 黄色帽

9、20X浓缩洗涤液  40ml…………………………白色帽

10、2X浓缩复溶液   50ml…………………………蓝色帽

【所用仪器、试剂】   

仪器：微孔板酶标仪450nm/630nm、旋转蒸发仪/氮气吹干装置、均质器、振荡器、离心机、刻度移液管、天平（感量0.01g ）

微量移液器：单道 20µl～200µl、100µl～1000µl、多道 250µl

试           剂：Na2HPO4·12H2O、 NaH2PO4·2H2O、NaCl

【实验前溶液配制】

配液1、0.02M PBS缓冲液         5.16gNa2HPO4*12H2O+0.87gNaH2PO4*2H2O

        +8.5gNaCl，加入蒸馏水至1000ml）用于样品提取液的配制。

配液2、 将2X浓缩复溶液用去离子水按1：1稀释。(1份浓缩复溶掖+1份去离子水，用于抗体的稀释和样本提取后的复溶)。

配液3、将40ml浓缩洗涤液（20倍浓缩）用去离子水按照

              1：19稀释（1份浓缩洗涤液+19份去离子水），或按

             所需用量配制洗涤液。

【样本前处理步骤】   

处理任何样本时，都必须注意：

（a）实验中必须使用一次性吸头，在吸取不同的试剂时要更换吸头。

（b）实验之前须检查各种实验器具是否干净，必要时可对实验器具进行清洁，以避免污染干扰实验结果。

(a)组织/蜂蜜样本前处理方法

1、 取2±0.05g样本与4ml 0.02MPBS缓冲液震荡混合5min，置65℃水浴环境放置10min；

2、 3000g以上，室温离心10min；

3、 取50ul上清液，加入450ul 稀释后的复溶液混匀，混合30s；

4、 取50ul用于分析。

5、 样本稀释倍数：20

（b）牛奶

1、取1ml牛奶样本于离心管中，在3000r/min，4℃离心10min，去除上层脂肪。

2、取50ul上清液，加入950ul 稀释后的复溶液混匀，混合30s2、

3、取50µl液体用于分析。

          样本稀释倍数：20倍

（c）细胞培养液

4、取1ml细胞培养液于离心管中，在3000r/min，4℃离心10min，去除上层脂肪。

5、取10ul上清液，加入390ul 稀释后的复溶液混匀，混合30s2、

6、取50µl液体用于分析。

          样本稀释倍数：40倍

【酶标免疫分析程序】   

操作步骤：

1、 从4℃冷藏环境中取出所需试剂，置室 温（20-25℃）平衡30min以上，注意每种液体试剂使用前均须摇匀。

2、 取出框架及需要数量的微孔，将不用的微孔放入自封袋，保存于2-8℃。

3、 编号：将样本和标准品对应微孔按序编号，每个样本和标准品做2孔平行，并记录标准孔和样本孔所在的位置。

4、 加标准品或样本50µl/孔到各自的微孔中，然后加抗体50µl/孔，用盖板膜封板，轻轻振荡混匀。25℃环境中反应30min。

5、 取出将孔内液体甩干，用洗液250µl /孔，洗板4－5次，每次间隔15-30s，用吸水纸拍干（拍干后未被清除的气泡可用干净的枪头刺破）。

6、 每孔加入酶标记物100µl，盖板膜盖板后置25℃环境中反应30min。取出将孔内液体甩干，用洗液250µl /孔，洗板4－5次，每次间隔15-30s，用吸水纸拍干（拍干后未被清除的气泡可用干净的枪头刺破）。

7、 显色：每孔加入底物液A液50µl， 再加B液50µl，轻轻振荡混匀，25℃环境中避光显色15min。

8、 测定：每孔加入终止液50µl，轻轻振荡混匀，设定酶标仪于450nm处（建议用双波长450/630nm检测，在5min内读完数据），测定每孔OD值。

【结果判定】   

结果判定有两种方法，粗略判定可用第1种方法，定量判定用第2种方法。注意样本吸光值与其所含庆大霉素成负相关。