人CD28分子（CD28）试剂盒（ELISA）使用说明书

l 本试剂盒用于体外定量检测血清、血浆、组织、细胞上清及相关液体样 本中人CD28分子（CD28）的含量。
l 有效期：6个月
l 保存条件：2-8℃

实验原理
试剂盒采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验（ELISA）。往预先包被人CD28分子（CD28） 捕获抗体的包被微孔中，依次加入标本、标准品、HRP标记的检测抗体，经过温育并彻底洗涤。 用底物TMB显色，TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。 颜色的深浅和样品中的人CD28分子（CD28）呈正相关。用酶标仪在450nm 波长下测定吸光度  （OD 值），计算样品浓度。

样本处理及要求
1.    血清：全血标本请于室温放置2小时或4℃过夜后于1000g离心20分钟，取上清即可检测， 或将标本放于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。
2.    血浆：可用EDTA或肝素作为抗凝剂， 标本采集后30分钟内于2 - 8°C 1000g离心20分钟， 或将标本放于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。
3.    细胞培养物上清或其它生物标本：1000g离心20分钟，取上清即可检测，或将标本放于-20℃ 或-80℃保存，但应避免反复冻融。
注：标本溶血会影响最后检测结果， 因此溶血标本不宜进行此项检测。

需要而未提供的试剂和器材
1.   酶标仪（450nm）
2.   高精度加样器及枪头：0.5-10uL 、2-20uL 、20-200uL 、200-1000uL
3.   37℃恒温箱
4. 蒸馏水或去离子水

试剂盒组成
名称        96 孔配置        48 孔配置        备注
微孔酶标板    8 孔×12 条    8 孔×6 条        无
标准品        0.3mL*6 管    0.3mL*6 管    无
样本稀释液    6mL        3mL        无
检测抗体-HRP    10mL        5mL        无
20×洗涤缓冲液    25mL        15mL        按说明书进行稀释
底物 A        6mL        3mL        无
底物 B        6mL        3mL        无
终止液        6mL        3mL        无
封板膜        2 张        2 张        无
说明书        1 份        1 份        无
自封袋        1 个        1 个        无
备注：
1.    标准品浓度依次为： 16 、8 、4 、2 、1 、0 ng/mL
2.    经过大量正常标本检验，标本的正常浓度值均在试剂盒提供的检测范围内，实验过程中 直接取50μL样本上样即可。当有部分样本值超过最大标准品浓度时，可用样本稀释液将标本 进行适当稀释后再进行实验。

注意事项
1.    严格按照规定的时间和温度进行温育以保证准确结果。所有试剂都必须在使用前达到室 温 20-25℃。使用后立即冷藏保存试剂。
2.    洗板不正确可以导致不准确的结果。在加入底物前确保尽量吸干孔内液体。温育过程中 不要让微孔干燥掉。
3.    消除板底残留的液体和手指印，否则影响OD 值。
4.    底物显色液应呈无色或很浅的颜色， 已经变蓝的底物液不能使用。
5.    避免试剂和标本的交叉污染以免造成错误结果。
6.    在储存和温育时避免强光直接照射。
7.    平衡至室温后再打开密封袋以防水滴凝聚在冷板条上。
8.    任何反应试剂不能接触漂白溶剂或漂白溶剂所散发的强烈气体。任何漂白成分都会破坏 试剂盒中反应试剂的生物活性。
9.    不能使用过期产品。
10.  如果可能传播疾病，所有的样品都应管理好，按照规定的程序处理样品和检测装置。

试剂准备
试剂盒从冷藏环境中取出应在室温平衡后方可使用。
20×洗涤缓冲液的稀释：蒸馏水按1：20稀释，即1份20×洗涤缓冲液加19份蒸馏水。

操作步骤
1.    从室温平衡 20min 后的铝箔袋中取出所需板条，剩余板条用自封袋密封放回4℃。
2.    设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品 50μL；
3.    样本孔中加入待测样本50μL；空白孔不加。
4.    除空白孔外，标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的检测抗体 100μL ，用封板膜封住反应孔，37℃水浴锅或恒温箱温育 60min。
5.    弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液（350μL），静置 1min，甩去洗涤液，吸水纸 上拍干，如此重复洗板 5 次（也可用洗板机洗板）。
6.    每孔加入底物 A、B 各 50μL ，37℃避光孵育 15min。
7.    每孔加入终止液 50μL ，15min 内，在 450nm 波长处测定各孔的OD 值。

实验结果计算
以所测标准品的OD值为横坐标，标准品的浓度值为纵坐标，在坐标纸上或用相关软件绘 制标准曲线，并得到直线回归方程，将样品的OD值代入方程，计算出样品的浓度。

试剂盒性能
1.   检测范围：0.5 ng/mL – 16 ng/mL。
2.   灵敏度：最低检测浓度小于 0.1 ng/mL。
3.   特异性：不与其它可溶性结构类似物交叉反应。
4.   重复性：板内变异系数小于 10%  ，板间变异系数小于 15%  。