细胞ERK1/2激酶总活性光度法定量检测试剂盒的用途
主要用途
细胞ERK1/2激酶总活性光度法定量检测试剂是一种旨在通过多肽底物，在ERK1/2激酶敏感性抑制剂存在与否的情况下，受到ERK1/2激酶磷酸化后，进而由丙酮酸激酶和乳酸脱氢酶连续循环法反应系统，测定产生ADP过程中，伴随的还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）的氧化反应， 即采用光度法测定其氧化后吸光峰值的变化，以分析细胞裂解样品中ERK1/2激酶总活性的权威而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。其适用于各种细胞裂解萃取液样品（动物、人体）、部分或完全纯化酶样品中ERK1/2激酶的定量检测，以及抑制剂和激活剂的筛选。产品严格无菌，即到即用，操作简捷，性能稳定，高度敏感。
技术背景
细胞外信号调节性激酶（extracellular signal regulated kinase；ERK；EC），又称为经典促分裂素原活化蛋白激酶（classical mitogen activated protein kinase），属于促分裂素原活化蛋白激酶（MAPK）一类中，包括JNK（c-Jun amino terminal kinase）、ERK、P38、Big MAPK1等的一员。在哺乳动物细胞中，促分裂素原活化蛋白激酶通路包含有三大通路，Erk信号通路是其中之一，高度进化保留。Erk/MAPK是脯氨酸定向性丝氨酸/苏氨酸（serine/threonine）蛋白激酶，在大多数组织中表达。和P38、JNK通路一起，将细胞外信号转化为特定细胞反应。Erk通路受到各种刺激例如生长因子、细胞因子、病毒感染、肿瘤因子等，由受体信号传导到细胞核内的目标分子，通过Ras磷酸化Raf，进而激活MAP激酶激酶1和2（MEK1和2），再磷酸化Erk激酶，然后激活一系列下游底物，包括核糖体S6激酶（ribosomal S6 kinase；RSK）、转录因子、髓鞘碱性蛋白（myelin basic protein）等，以调节细胞生长、繁殖、分化、压力生存（stress survival）、减数分裂、有丝分裂、细胞形态维持、细胞骨架的构建、细胞凋亡和细胞的恶变。Erk激酶有5型，其中主要分为1型和2型，其中1型又称为MAPK3，44Kd分子量，主要调节胸腺细胞成熟；2型又称为MAPK1，42Kd分子量。Erk通路异常，与乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌等发生有关。Erk磷酸化目标序列为髓鞘碱性蛋白性多肽ATGPLSPGPFGRR。基于底物ATGPLSPGPFGRR，在ERK1/2激酶敏感性抑制剂FR180204（5-(2-Phenyl-pyrazolo[1,5-a]pyridin-3-yl)-1H-pyrazolo[3,4-c]pyridazin-3-ylamine）的存在与否的情况下，受到ERK1/2激酶的磷酸化，获得产物磷酸化多肽，进而通过丙酮酸激酶（pyruvate kinase；PK）和乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase；LDH）反应系统中，还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（reduced nicotinamide adenine dinucleotide；NADH）转化为氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide；NAD），其吸光峰值的变化（340nm），来定量分析ERK1/2激酶的总活性。其反应方式为：
ERK1/2
ATGPLSPGPFGRR + ATP → ATGPLpSPGPFGRR + ADP
pyruvate kinase
Phosphoenolpyruvate + ADP → pyruvate + ATP
lactate dehydrogenase
pyruvate + NADH → lactate + NAD+
（高吸收峰）（低吸收峰）
产品内容
清理液（Reagent A） 120毫升
裂解液（Reagent B） 10毫升
缓冲液（Reagent C） 10毫升
酶促液（Reagent D） 1毫升
反应液（Reagent E） 1毫升
底物液（Reagent F） 1毫升
阴性液（Reagent G） 500微升
专性液（Reagent H） 200微升
产品说明书 1份
保存方式
保存清理液（Reagent A）在4℃冰箱里；其余的保存在－20℃冰箱里，严格避免光照和反复冻融；有效保证6月
用户自备
ERK1/2激酶：用于抑制剂筛选
1.5毫升离心管：用于样品操作和保存的容器
15毫升锥形离心管：用于样品处理的容器
细胞刮脱棒：用于贴壁细胞脱离
（微型）台式离心机：用于细胞预处理
200微升1厘米光径比色皿或96孔板：用于光度分析操作的容器
分光光度仪或酶标仪：用于样品光度分析
实验步骤
一、 待测样品准备
1． 准备好75cm2细胞培养瓶或100mm细胞培养皿的待测培养细胞（1至5 X 107细胞）
2． 小心加入3毫升清理液（Reagent A），覆盖生长表面
3． 小心抽去清理液
4． 使用细胞刮脱棒轻柔刮脱细胞（注意：避免使用胰酶消化）
5． 加入3毫升清理液（Reagent A），混匀细胞
6． 移入到预冷的15毫升锥形离心管（注意：悬浮细胞从这一步骤开始）
7． 放进4℃台式离心机离心5分钟，速度为300g
8． 小心抽去上清液
9． 加入100至500微升裂解液（Reagent B），充分混匀（注意：可以调节蛋白浓度）
10． 转移到预冷的1.5毫升离心管
11． 强力涡旋震荡15秒
12． 置于冰槽里孵育30分钟
13． 放进4℃微型台式离心机离心5分钟，速度为16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）
14． 小心移取100至500微升上清液到新的预冷的1.5毫升离心管
15． 移取10微升进行蛋白定量检测（注意：建议使用 Bradford蛋白质浓度定量试剂盒－GMS30030.1）
16． 即刻放进－70℃保存或置于冰槽里继续后续操作
二、 测定准备
1． 准备好待测样品（例如细胞裂解悬液等），置于冰槽里
2． 设定好分光光度仪（温度为30℃）：波长为340nm，间隔1分钟，读数6次（共5分钟），并置零
3． 缓冲液（Reagent C）室温下均衡温度
三、 背景对照测定
1． 移取130微升缓冲液（Reagent C）到新的比色皿
2． 加入20微升酶促液（Reagent D）
3． 加入20微升反应液（Reagent E）
4． 加入20微升底物液（Reagent F）
5． 放进30℃培养箱里静置3分钟
6． 加入10微升阴性液（Reagent G）
7． 上下倾倒数次，混匀（限定在3秒之内）
8． 即刻放进分光光度仪检测，此为背景空对照：340波长读数0分钟 －340波长读数5分钟
四、 样品总活性测定
1． 移取130微升缓冲液（Reagent C）到新的比色皿
2． 加入20微升酶促液（Reagent D）
3． 加入20微升反应液（Reagent E）
4． 加入20微升底物液（Reagent F）
5． 放进30℃培养箱里静置3分钟
6． 加入10微升待测样品（注意：100微克细胞裂解蛋白；样品须溶解）
7． 上下倾倒数次，混匀（限定在3秒之内）
8． 即刻放进分光光度仪检测，此为样品总活性读数：340波长读数0分钟 －340波长读数5分钟
五、 样品非特异活性测定
检测开始前，移取20微升缓冲液（Reagent C）到1.5毫升离心管，分别加入10微升专性液（Reagent H）和待测样品（注意：100微克细胞裂解蛋白），混匀后，放进30℃培养箱里孵育30分钟。然后继续下列操作。
1． 移取100微升缓冲液（Reagent C）到新的比色皿
2． 加入20微升酶促液（Reagent D）
3． 加入20微升反应液（Reagent E）
4． 加入20微升底物液（Reagent F）
5． 放进30℃培养箱里静置3分钟
6． 加入40微升上述预处理的待测样品
7． 上下倾倒数次，混匀（限定在3秒之内）
8． 即刻放进分光光度仪检测，此为样品非特异活性读数：340波长读数0分钟 －340波长读数5分钟
六、 计算样品活性
1） 样品总活性和非特异活性计算
[（样品读数－背景读数）X 0.2（毫升，体系容量）X样品稀释倍数]÷[0.010（样品容量；毫升）X 6.22（毫摩尔吸光系数）X 5（反应时间；分钟）]＝单位/毫升÷（样品蛋白浓度）毫克/毫升＝单位/毫克
单位＝微摩尔NADH/分钟
或
[（样品读数－背景读数）X 0.2（毫升，体系容量）X样品稀释倍数]÷[0.10（样品蛋白量；毫克）X 6.22（毫摩尔吸光系数）X 5（反应时间；分钟）]＝单位/毫克
单位＝微摩尔NADH/分钟
2）样品特异活性计算
特异活性＝总活性－非特异活性
六、酶标仪测定
1）样品总活性测定
1． 在96孔板上做好相应标记：背景对照和样品
2． 分别移取130微升缓冲液（Reagent C）到96孔板里
3． 分别加入20微升酶促液（Reagent D）
4． 分别加入20微升反应液（Reagent E）
5． 分别加入20微升底物液（Reagent F）
6． 轻轻摇动96孔板
7． 在30℃温度下孵育3分钟
8． 分别加入10微升阴性液（Reagent G）或待测样品（100微克细胞裂解悬液蛋白）到相应孔里（注意：样品须清澈）
9． 轻轻摇动96孔板
10． 即刻放进酶标仪检测：0分钟读数和5分钟读数
11． 活性计算：
[（样品读数－背景读数）X样品稀释倍数X 0.2（体系容量；毫升）]÷[0.010（样品容量；毫升）X 6.22（毫摩尔吸光系数）X 0.5（光径距离；厘米）X 5（反应时间；分钟）]＝单位/毫升÷（样品蛋白浓度）毫克/毫升＝单位/毫克
单位＝微摩尔NADH/分钟
或
[（样品读数－背景读数）X样品稀释倍数X 0.2（体系容量；毫升）]÷[0.10（样品蛋白量；毫克）X 6.22（毫摩尔吸光系数）X 0.5 （光径距离；厘米）X 5（反应时间；分钟）]＝单位/毫克
单位＝微摩尔NADH/分钟
2） 样品非特异活性测定
检测开始前，移取20微升缓冲液（Reagent C）到1.5毫升离心管，分别加入10微升专性液（Reagent H）和待测样品（注意：100微克细胞裂解蛋白），混匀后，放进30℃培养箱里孵育30分钟。然后继续下列操作。
1． 在96孔板上做好相应标记：待测样品
2． 移取100微升缓冲液（Reagent C）到96孔板里
3． 加入20微升酶促液（Reagent D）
4． 加入20微升反应液（Reagent E）
5． 加入20微升底物液（Reagent F）
6． 轻轻摇动96孔板
7． 在30℃温度下孵育3分钟
8． 加入40微升上述预处理的待测样品
9． 轻轻摇动96孔板
10． 即刻放进酶标仪检测：0分钟读数和5分钟读数
11． 活性计算：
[（样品读数－背景读数）X样品稀释倍数X 0.2（体系容量；毫升）]÷[0.010（样品容量；毫升）X 6.22（毫摩尔吸光系数）X 0.5（光径距离；厘米）X 5（反应时间；分钟）]＝单位/毫升÷（样品蛋白浓度）毫克/毫升＝单位/毫克
单位＝微摩尔NADH/分钟
或
[（样品读数－背景读数）X样品稀释倍数X 0.2（体系容量；毫升）]÷[0.1（样品蛋白量；毫克）X 6.22（毫摩尔吸光系数）X 0.5（光径距离；厘米）X 5（反应时间；分钟）]＝单位/毫克
单位＝微摩尔NADH/分钟
3） 样品特异活性计算
特异活性＝总活性－非特异活性
七、抑制剂筛选
1． 在96孔板上做好相应标记：背景、完全活性和待测抑制剂样品
2． 按下表加入试剂，进行样品预处理
| 内容物 | 空背景对照 | 样本背景 | 完全酶活性 | 待测抑制剂酶活性 |
| 缓冲液（Reagent C） | 20微升 | 20微升 | 20微升 | 20微升 |
| 阴性液（Reagent G） | 20微升 | 10微升 | 10微升 | —— |
| 待测抑制剂 | —— | 10微升 | ―― | 10微升 |
| 用户自备的纯化酶 | —— | —— | 10微升（1毫单位） | 10微升（1毫单位） |
| 96孔板每孔总量 | 空背景对照孔 （40微升） | 样本背景孔 （40微升） | 完全活性孔 （40微升） | 待测抑制剂样品孔 （40微升） |
| 轻轻摇动96孔板，混匀，放进30℃培养箱里孵育30分钟。然后进行下列操作 | ||||
3． 分别移取100微升缓冲液（Reagent C）到新的96孔板的所有孔里
4． 分别加入20微升酶促液（Reagent D）
5． 分别加入20微升反应液（Reagent E）
6． 分别加入20微升底物液（Reagent F）
7． 轻轻摇动96孔板
8． 在30℃温度下孵育3分钟
9． 加入40微升上述预处理的待测样品
10． 即刻放进30℃酶标仪检测：测读30分钟
11． 抑制活性计算：
1) [（完全活性读数－空背景对照读数）－（抑制剂样品活性读数－样本背景读数）]÷（完全活性读数－空背景对照读数）＝实际抑制百分率
2) IC50：50％抑制率所需的抑制剂浓度
X（所需抑制剂样品浓度）＝（已知抑制剂样品浓度÷实际抑制百分率）X 50％
3) 直接构建抑制曲线：纵座标（Y轴）为吸光单位（OD）；横座标（X轴）为已知抑制剂浓度
注意事项
1． 本产品为20次操作
2． 操作时，须戴手套
3． 系统操作过程中，背景测定只需1次
4． 样品处理忌用磷酸缓冲溶液
5． 样品须澄清，至关重要
6． 加入样品启动反应后3秒内即刻光度测定
7． 建议使用比色皿测定
8． 测定值由高到低变化；测定可持续30分钟
9． 光度测定后，比色皿须清洗彻底
10． 样本测定0分钟读数高于5分钟读数表明具有酶活性
11． 样本测定读数持续上升，表明酶活过低或样品量过低
12． 非特异活性高于总活性，表明特异性酶活过低或样品量过低
13． 建议待测样本蛋白浓度为100微克/10微升（本公司提供 Bradford蛋白质浓度定量试剂盒－GMS30030.1）
14． 如果待测样品浓度过高或过低，可以调整样品浓度
15． ERK激酶活性单位浓度定义：在30℃温度下，pH 7.5条件下，每分钟内能够氧化1微摩尔还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）所需的酶量作为一个活性单位
16． 本公司提供系列蛋白激酶检测试剂产品
质量标准
1． 本产品经鉴定性能稳定
2． 本产品经鉴定检测敏感
使用承诺
秉着“信誉至上、客户满意、质量承诺”的宗旨为我们的用户提供优质产品和服务。用户收到货后，应按照产品说明书上的规定妥善保管并在有效期内使用。我们的产品在销售前已作严格的质量鉴定，保证说明书所述的使用效果。在货到后10天内若发现确属本产品的质量问题，请立即以书面形式（实验报告）与本公司联系，并将该产品退回，经检验确系产品质量所致，本公司负责更换产品。如系使用者错误操作所致，本公司不承担由此造成的损失。
友情提醒
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订购信息
单组分订购信息
编号名称规格
GMS50056.1.3细胞ERK1/2激酶总活性光度法定量检测试剂盒20次
GMS50056.1.3A清理液（Reagent A） 100毫升
GMS50056.1.3B裂解液（Reagent B） 100毫升
GMS50056.1.3C 缓冲液（Reagent C） 50毫升
GMS50056.1.3D酶促液（Reagent D） 5毫升
GMS50056.1.3E 反应液（Reagent E） 5毫升
GMS50056.1.3F底物液（Reagent F） 5毫升
GMS50056.1.3G阴性液（Reagent G） 5毫升
GMS50056.1.3H专性液（Reagent H） 1毫升
试剂盒订购信息
| 产品编号 | 名称 | 规格 |
| GMS50056.1 | 细胞ERK1/2激酶总活性光度法定量检测试剂盒 | 20次 |
| GMS50056.2 | 组织ERK1/2激酶总活性光度法定量检测试剂盒 | 20次 |
| GMS50159.1 | 细胞ERK1激酶活性光度法定量检测试剂盒 | 20次 |
| GMS50159.2 | 组织ERK1激酶活性光度法定量检测试剂盒 | 20次 |
| GMS50159.3 | 细胞ERK2激酶活性光度法定量检测试剂盒 | 20次 |
| GMS50159.4 | 组织ERK2激酶活性光度法定量检测试剂盒 | 20次 |
尊敬的客户
您好！ 上海极威生物科技有限公司（Shanghai JIwei Biological Technology Co., Ltd.）成立于上海，是一家专业从事“产品研发、市场销售、技术服务”为一体的高科技生物技术公司。极威生物依托国内外技术研发人才的优势，由留美资深科学家与数位国内多年从事生物领域研究的博士、硕士等高校生物领域研究人员共同创立，在科学研究和医疗检测领域享有极高的声誉，经过多年的努力发展已成为专业供应各类生物科研用品的公司，长期专注于生物领域，旗下产品种类众多。极威生物秉承以产品质量为根本，以市场需求为导向，以为客户创造价值为己任的精神，致力于发展中国的科研事业。力求为我国生物科技事业提供更好的、更专业性的技术服务和科研产品。自公司成立以来，公司的销售额保持高速增长，企业规模不断扩大，研发产品包括elisa试剂盒，生化试剂盒，动物血制品，抗体，标准品，生化试剂，实验耗材等10万余种类，公司长期致力于elisa试剂盒、生化试剂盒的研发，为客户提供生化试剂盒、ELISA试剂盒、技术服务等一系列实验代测服务。
