细胞PKC激酶活性光度法定量检测试剂盒产品说明书（中文版）
主要用途
细胞PKC激酶活性光度法定量检测试剂是一种旨在通过多肽底物受到PKC磷酸化后，进而由丙酮酸激酶和乳酸脱氢酶连续循环法反应系统，测定产生ADP过程中，伴随的还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）的氧化反应， 即采用光度法测定其氧化后吸光峰值的变化，以分析细胞裂解样品中PKC活性的权威而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。其适用于各种细胞裂解萃取液样品（动物、人体）、部分或完全纯化酶样品中PKC激酶的定量检测，以及抑制剂和激活剂的筛选。产品严格无菌，即到即用，操作简捷，性能稳定，高度敏感。
技术背景
蛋白激酶C（protein kinase C；PKC；EC2.7.11.13），属于丝氨酸/苏氨酸激酶（serine/threonine protein kinase；EC2.7.11.1）家属的成员，是哺乳动物细胞信号的重要分子之一。PKC拥有10个同工酶，包括经典型PKC（classical PKC；cPKC），需要钙离子、二乙酰基甘油（DAG）和磷脂激活，例如α，βI， βII和γ；新型PKC（novel PKC；nPKC），仅需要二乙酰基甘油（DAG）激活，例如δ，ε，η和θ；以及非典型PKC（atypical PKC；aPKC），例如ζ，ι 和λ。所有同工酶具有70％的氨基酸序列同源性。磷酸化下游蛋白后，可以达到肌肉收缩、腺体分泌、糖原分解、血小板凝结等信号传递功能。其磷酸化目标序列为RRGRTGRGRRGIFR。基于底物RRGRTGRGRRGIFR，在ATP的存在下，受到PKC激酶的磷酸化，获得产物磷酸化多肽，进而通过丙酮酸激酶（pyruvate kinase；PK）和乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase；LDH）反应系统中，还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（reduced nicotinamide adenine dinucleotide；NADH）转化为氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide；NAD），其吸光峰值的变化（340nm），来定量分析蛋白激酶C的活性。其反应方式为：
PKC
RRGRTGRGRRGIFR + ATP → RRGRpTGRGRRGIFR + ADP
pyruvate kinase
Phosphoenolpyruvate + ADP → pyruvate + ATP
lactate dehydrogenase
pyruvate + NADH → lactate + NAD+
（高吸收峰）（低吸收峰）
产品内容
清理液（Reagent A） 120毫升
裂解液（Reagent B） 10毫升
缓冲液（Reagent C） 4毫升
酶促液（Reagent D） 500微升
反应液（Reagent E） 500微升
底物液（Reagent F） 500微升
阴性液（Reagent G） 500微升
产品说明书 1份
保存方式
保存清理液（Reagent A）在4℃冰箱里；其余的保存在－20℃冰箱里，严格避免光照和反复冻融；有效保证6月
用户自备
PKC激酶：用于抑制剂筛选
1.5毫升离心管：用于样品保存的容器
15毫升锥形离心管：用于样品处理的容器
细胞刮脱棒：用于贴壁细胞脱离
（微型）台式离心机：用于细胞预处理
200微升1厘米光径比色皿或96孔板：用于光度分析操作的容器
分光光度仪或酶标仪：用于样品光度分析
实验步骤
一、 待测样品准备
1． 准备好75cm2细胞培养瓶或100mm细胞培养皿的待测培养细胞（1至5 X 107细胞）
2． 小心加入3毫升清理液（Reagent A），覆盖生长表面
3． 小心抽去清理液
4． 使用细胞刮脱棒轻柔刮脱细胞（注意：避免使用胰酶消化）
5． 加入3毫升清理液（Reagent A），混匀细胞
6． 移入到预冷的15毫升锥形离心管（注意：悬浮细胞从这一步骤开始）
7． 放进4℃台式离心机离心5分钟，速度为300g
8． 小心抽去上清液
9． 加入100至500微升裂解液（Reagent B），充分混匀（注意：可以调节蛋白浓度）
10． 转移到预冷的1.5毫升离心管
11． 强力涡旋震荡15秒
12． 置于冰槽里孵育30分钟
13． 放进4℃微型台式离心机离心5分钟，速度为16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）
14． 小心移取100至500微升上清液到新的预冷的1.5毫升离心管
15． 移取10微升进行蛋白定量检测（注意：建议使用 Bradford蛋白质浓度定量试剂盒－GMS30030.1）
16． 即刻放进－70℃保存或置于冰槽里继续后续操作
二、 测定准备
1． 准备好待测样品（例如细胞裂解悬液等），置于冰槽里
2． 设定好分光光度仪（温度为30℃）：波长为340nm，间隔1分钟，读数6次（共5分钟），并置零
3． 缓冲液（Reagent C）室温下均衡温度
三、 背景对照测定
1． 移取130微升缓冲液（Reagent C）到新的比色皿
2． 加入20微升酶促液（Reagent D）
3． 加入20微升反应液（Reagent E）
4． 加入20微升底物液（Reagent F）
5． 放进30℃培养箱里静置3分钟
6． 加入10微升阴性液（Reagent G）
7． 上下倾倒数次，混匀（限定在3秒之内）
8． 即刻放进分光光度仪检测，此为背景空对照：340波长读数0分钟 －340波长读数5分钟
四、 样品测定
1． 移取130微升缓冲液（Reagent C）到新的比色皿
2． 加入20微升酶促液（Reagent D）
3． 加入20微升反应液（Reagent E）
4． 加入20微升底物液（Reagent F）
5． 放进30℃培养箱里静置3分钟
6． 加入10微升待测样品（注意：100微克细胞裂解蛋白；样品须溶解）
7． 上下倾倒数次，混匀（限定在3秒之内）
8． 即刻放进分光光度仪检测，此为样品总活性读数：340波长读数0分钟 －340波长读数5分钟
五、 计算样品活性
[（样品读数－背景读数）X 0.2（体系容量；毫升）X样品稀释倍数]÷[0.010（样品容量；毫升）X 6.22（毫摩尔吸光系数）X 5（反应时间；分钟）]＝单位/毫升÷（样品蛋白浓度）毫克/毫升＝单位/毫克
单位＝微摩尔NADH/分钟
六、 酶标仪测定
1． 在96孔板上做好相应标记：背景对照和样品
2． 分别移取130微升缓冲液（Reagent C）到96孔板里
3． 分别加入20微升酶促液（Reagent D）
4． 分别加入20微升反应液（Reagent E）
5． 分别加入20微升底物液（Reagent F）
6． 轻轻摇动96孔板
7． 在30℃温度下孵育3分钟
8． 分别加入10微升阴性液（Reagent G）或待测样品（100微克细胞裂解悬液蛋白）到相应孔里（注意：样品须清澈）
9． 轻轻摇动96孔板
10． 即刻放进酶标仪检测：0分钟读数和5分钟读数
11． 活性计算：
[（样品读数－背景读数）X样品稀释倍数X 0.2（体系容量；毫升）]÷[0.010（样品容量；毫升）X 6.22（毫摩尔吸光系数）X 0.5（光径距离；厘米）X 5（反应时间；分钟）]＝单位/毫升÷（样品蛋白浓度）毫克/毫升＝单位/毫克
单位＝微摩尔NADH/分钟
七、抑制剂筛选
1． 在96孔板上做好相应标记：背景、完全活性和待测抑制剂样品
2． 按下表加入试剂，进行样品预处理
| 内容物 | 空背景对照 | 样本背景 | 完全酶活性 | 待测抑制剂酶活性 |
| 缓冲液（Reagent C） | 20微升 | 20微升 | 20微升 | 20微升 |
| 阴性液（Reagent G） | 20微升 | 10微升 | 10微升 | —— |
| 待测抑制剂 | —— | 10微升 | ―― | 10微升 |
| 用户自备的纯化酶 | —— | —— | 10微升（1毫单位） | 10微升（1毫单位） |
| 96孔板每孔总量 | 空背景对照孔 （40微升） | 样本背景孔 （40微升） | 完全活性孔 （40微升） | 待测抑制剂样品孔 （40微升） |
| 轻轻摇动96孔板，混匀，放进30℃培养箱里孵育30分钟。然后进行下列操作 | ||||
3． 分别移取100微升缓冲液（Reagent C）到新的96孔板的所有孔里
4． 分别加入20微升酶促液（Reagent D）
5． 分别加入20微升反应液（Reagent E）
6． 分别加入20微升底物液（Reagent F）
7． 轻轻摇动96孔板
8． 在30℃温度下孵育3分钟
9． 加入40微升上述预处理的待测样品
10． 即刻放进30℃酶标仪检测：测读30分钟
11． 抑制活性计算：
1) [（完全活性读数－空背景对照读数）－（抑制剂样品活性读数－样本背景读数）]÷（完全活性读数－空背景对照读数）＝实际抑制百分率
2) IC50：50％抑制率所需的抑制剂浓度
X（所需抑制剂样品浓度）＝（已知抑制剂样品浓度÷实际抑制百分率）X 50％
3） 直接构建抑制曲线：纵座标（Y轴）为吸光单位（OD）；横座标（X轴）为已知抑制剂浓度
注意事项
1． 本产品为25次操作，包括背景操作
2． 操作时，须戴手套
3． 系统操作过程中，背景测定只需1次
4． 样品处理忌用磷酸缓冲溶液
5． 样品须澄清，至关重要
6． 建议使用比色皿测定
7． 加入样品启动反应后3秒内即刻光度测定
8． 测定值由高到低变化；测定可持续30分钟
9． 光度测定后，比色皿须清洗彻底
10． 样本测定0分钟读数高于5分钟读数表明具有酶活性
11． 样本测定读数持续上升，表明酶活过低或样品量过低
12． 建议待测样本蛋白浓度为100微克/10微升（本公司提供 Bradford蛋白质浓度定量试剂盒－GMS30030.1）
13． 如果待测样品浓度过高或过低，可以调整样品浓度
14． 可以使用PKC抑制剂作为抑制剂对照（IC50＝150纳摩尔）或阴性对照
15． 蛋白激酶C活性单位浓度定义：在30℃温度下，pH 7.5条件下，每分钟内能够氧化1微摩尔还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）所需的酶量作为一个活性单位
16． HeLa细胞PKC活性在50至2000皮摩尔/分钟/毫克
17． 本公司提供系列蛋白激酶检测试剂产品
质量标准
1． 本产品经鉴定性能稳定
2． 本产品经鉴定检测敏感
使用承诺
秉着“信誉至上、客户满意、质量承诺”的宗旨为我们的用户提供优质产品和服务。用户收到货后，应按照产品说明书上的规定妥善保管并在有效期内使用。我们的产品在销售前已作严格的质量鉴定，保证说明书所述的使用效果。在货到后10天内若发现确属本产品的质量问题，请立即以书面形式（实验报告）与本公司联系，并将该产品退回，经检验确系产品质量所致，本公司负责更换产品。如系使用者错误操作所致，本公司不承担由此造成的损失。
友情提醒
IF IT DOESN’T WORK， RECHECK YOUR EXPERIMENT TO SEE WHAT YOU DID WRONG。
订购信息
单组分订购信息
编号名称规格
GMS50126.1.3细胞PKC激酶活性光度法定量检测试剂盒20次
GMS50126.1.3A清理液（Reagent A） 500毫升
GMS50126.1.3B裂解液（Reagent B） 100毫升
GMS50126.1.3C 缓冲液（Reagent C） 50毫升
GMS50126.1.3D酶促液（Reagent D） 5毫升
GMS50126.1.3E 反应液（Reagent E） 5毫升
GMS50126.1.3F底物液（Reagent F） 5毫升
GMS50126.1.3G阴性液（Reagent G） 5毫升
试剂盒订购信息
| 产品编号 | 名称 | 规格 |
| GMS50126.1 | 细胞PKC激酶活性光度法定量检测试剂盒 | 20次 |
| GMS50126.2 | 组织PKC激酶活性光度法定量检测试剂盒 | 20次 |
| GMS50178.1 | 细胞PKCα激酶活性光度法定量检测试剂盒 | 20次 |
| GMS50178.2 | 组织PKCα激酶活性光度法定量检测试剂盒 | 20次 |
| GMS50178.3 | 细胞PKCβ1激酶活性光度法定量检测试剂盒 | 20次 |
| GMS50178.4 | 组织PKCβ1激酶活性光度法定量检测试剂盒 | 20次 |
| GMS50178.5 | 细胞PKCβ2激酶活性光度法定量检测试剂盒 | 20次 |
| GMS50178.6 | 组织PKCβ2激酶活性光度法定量检测试剂盒 | 20次 |
| GMS50178.7 | 细胞PKCγ激酶活性光度法定量检测试剂盒 | 20次 |
| GMS50178.8 | 组织PKCγ激酶活性光度法定量检测试剂盒 | 20次 |
| GMS50178.9 | 细胞PKCδ激酶活性光度法定量检测试剂盒 | 20次 |
| GMS50178.10 | 组织PKCδ激酶活性光度法定量检测试剂盒 | 20次 |
| GMS50178.11 | 细胞PKCε激酶活性光度法定量检测试剂盒 | 20次 |
| GMS50178.12 | 组织PKCε激酶活性光度法定量检测试剂盒 | 20次 |
| GMS50178.13 | 细胞PKCζ激酶活性光度法定量检测试剂盒 | 20次 |
| GMS50178.14 | 组织PKCζ激酶活性光度法定量检测试剂盒 | 20次 |
| GMS50178.15 | 细胞PKCη激酶活性光度法定量检测试剂盒 | 20次 |
| GMS50178.16 | 组织PKCη激酶活性光度法定量检测试剂盒 | 20次 |
| GMS50178.17 | 细胞PKCθ激酶活性光度法定量检测试剂盒 | 20次 |
| GMS50178.18 | 组织PKCθ激酶活性光度法定量检测试剂盒 | 20次 |
| GMS50178.19 | 细胞PKCι激酶活性光度法定量检测试剂盒 | 20次 |
| GMS50178.20 | 组织PKCι激酶活性光度法定量检测试剂盒 | 20次 |
