植物果胶甲酯酶（pectin methylesterase；PME）活性比色法定量检测试剂盒 产品说明书（中文版） 主要用途 植物果胶甲酯酶（pectin methylesterase；PME）活性比色法定量检测试剂是一种旨在通过果胶甲酯酶和酒 精氧化酶的酶偶联反应系统中产生的甲醛，与 N-甲基苯噻唑啉酮-2-腙反应，酸性氧化后，产生蓝色甲簪产 物，采用比色法测定其峰值的变化，以此进行测算单位酶活性的权威而经典的技术方法。该技术经过精心 研制、成功实验证明的。其适合于各种植物组织裂解悬液样品的果胶甲酯酶活性及其抑制剂的检测。产品 不含污染性蛋白酶，严格无菌，即到即用，操作简捷，性能稳定，反应优化，检测敏感。 技术背景 果胶甲酯酶（pectin methylesterase；PME；EC3.1.1.11），又称为果胶酯酶（pectinesterase），是一种细胞壁 相关的果胶水解（pectolytic）酶蛋白，分子量为34－37kDa，存在于所有植物组织中，以及植物病源菌（真 菌和细菌）里。果胶（pectin）是细胞壁的主要结构元素，占35％的多糖。果胶是同型聚糖半乳糖醛酸 （homogalacturonan；HGA）和鼠李聚糖半乳糖醛酸（rhmnogalacturonan；RG）的复合物。其中80％的同 型聚糖半乳糖醛酸为甲基酯化。果胶甲酯酶通过使果胶去酯化（deesterification），产生水溶性的果胶酸（pectic acid）和甲醇。植物果胶甲酯酶分成2型：I型和II型。其功能在于参与植物发育、形态形成、成熟、细胞壁 延展和稳固、水果软化脱落和衰老、防止感染等，以及细菌和真菌果胶降解等。果胶甲酯酶常用于果菜汁 等的澄清、液化、和水果软化和成熟。基于底物果胶，在果胶甲酯酶的催化下，产生果胶酸和甲醇，进而 在酒精氧化酶（alcohol oxidase）的作用下，产生并收集甲醛（aldehyde），同时使用N-甲基苯噻唑啉酮-2- 腙（N-methylbenzothiazolinone-2-hydrazone；MBTH），在中性条件下，进行浓缩反应，最后酸化处理，在 三价铁氧化剂的参与下，形成蓝色甲簪产物，在分光光度仪下（620nm波长），来定量分析果胶甲酯酶的总 活性。果胶甲酯酶酶偶联反应系统为： 产品内容 裂解液（Reagent A） 毫升 保存液（Reagent B） 毫升 缓冲液（Reagent C） 毫升 反应液（Reagent D） 微升 底物液（Reagent E） 微升 阴性液（Reagent F） 毫升 显色液（Reagent G） 毫升 产品说明书 1 份 保存方式 保存反应液（Reagent D）和底物液（Reagent E）在－20℃冰箱里，避免反复冻融；其余的保存在 4℃冰箱 里；显色液（Reagent G）避免光照，有效保证 6 月用户自备 15 毫升离心管：用于样品处理的容器 1.5 毫升离心管：用于样品处理和保存的容器 （微型）台式离心机：用于样品收集 DOUNCE 匀浆器：用于裂解组织 培养箱：用于孵育反应物 比色皿：用于比色的容器 分光光度仪：用于比色分析 实验步骤 实验开始前，将－20℃冰箱里的试剂盒中的试剂溶液放进冰槽里融化。然后进行下列操作。 一、 样品准备 1． 准备好新鲜植物组织，并秤重以确定组织重量 200 毫克 2． 移入到一个液氮冻存管 3． 即刻放进液氮罐过夜 4． 次日从液氮罐里取出，即刻（最快速度）用研磨棒碾碎组织成粉末状（注意：切莫使组织冻融） 5． 放进一个 15 毫升锥形离心管 6． 加入预冷的 xx 微升裂解液（Reagent A） 7． 涡旋震荡 5 秒，充分混匀 8． 即刻放入预冷的 DOUNCE 匀浆器 9． 在冰槽里用研磨棒匀化组织（约 80 下） 10．将所有组织匀浆物移入 1.5 毫升离心管 11．放进 4℃微型台式离心机离心 5 分钟，速度为 16000g（或 13000RPM，例如 eppendorf 5415） 12．小心抽去上清液 13．加入预冷的 xx 微升保存液（Reagent B），混匀 14．移取 10 微升进行蛋白定量检测（注意：建议使用 Bradford 蛋白质浓度定量试剂盒－GMS30030.1） 15．即刻放进－70℃保存或置于冰槽里继续后续操作 二、测定准备 1． 准备好待测样品（例如植物组织裂解萃取液等），置于冰槽里（注意：样品须澄清） 2． 设定好分光光度仪（温度为 30℃）：波长为 620nm，并置零 三、 背景测定 1． 移取 xx 微升缓冲液（Reagent C）到新的比色皿 2． 加入 xx 微升反应液（Reagent D） 3． 加入 xx 微升底物液（Reagent E） 4． 加入 xx 微升阴性液（Reagent F） 5． 在 30℃温度下孵育 60 分钟 6． 加入 xx 微升显色液（Reagent G），混匀 27． 室温下静置 30 分钟，避免光照 8． 加入 xx 微升阴性液（Reagent F），混匀 9． 即刻放进分光光度仪检测：获得背景吸光读数 四、 样品活性测定 1． 移取 xx 微升缓冲液（Reagent C）到新的比色皿 2． 加入 xx 微升反应液（Reagent D） 3． 加入 xx 微升底物液（Reagent E） 4． 加入 10 微升待测样品（总量 100 微克裂解萃取液蛋白） 5． 在 30℃温度下孵育 60 分钟 6． 加入 xx 微升显色液（Reagent G），混匀 7． 室温下静置 30 分钟，避免光照 8． 加入 xx 微升稀释液（Reagent F），混匀 9． 即刻放进分光光度仪检测：获得样品吸光读数 五、 计算样品活性 注意事项 1． 本产品为 20 次操作，包括背景对照测定 2． 操作时，须戴手套 3． 系统操作过程中，背景对照测定只需 1 次 4． 比色测定后，比色皿须清洗彻底 5． 测定值由低到高变化；反应可持续 3 小时 6． 显示蓝色表明具有酶活性 7． 样品读数高于背景读数表明具有酶活性 8． 建议待测样本蛋白浓度为 100 微克/10 微升；如果样本酶活性过低或过高，则可以增加或降低样本量； （本公司提供 Bradford 蛋白质浓度定量试剂盒－GMS30030.1） 9． 果胶甲酯酶活性单位浓度定义：在 30℃温度下，pH 7.5 的情况下，每单位酶在单位时间内（每小时） 水解产生 1 微摩尔的甲醇 10．本公司提供系列果胶甲酯酶检测试剂产品 质量标准 1． 本产品经鉴定性能稳定 2． 本产品经鉴定检测准确 使用承诺 极威生物秉着“信誉至上、客户满意、质量承诺”的宗旨为我们的用户提供优质产品和服务。用户收到货后， 应按照产品说明书上的规定妥善保管并在有效期内使用。我们的产品在销售前已作严格的质量鉴定，保证 说明书所述的使用效果。在货到后 10 天内若发现确属本产品的质量问题，请立即以书面形式（实验报告）34 与本公司联系，并将该产品退回，经检验确系产品质量所致，本公司负责更换产品。如系使用者错误操作 所致，本公司不承担由此造成的损失。 友情提醒 IF IT DOESN’T WORK， RECHECK YOUR EXPERIMENT TO SEE WHAT YOU DID WRONG。 订购信息 单组分订购信息 编号 名称 规格 GMS16038.1 植物果胶甲酯酶活性比色法定量检测试剂盒 20 次 GMS16038.1A 裂解液（Reagent A） 毫升 GMS16038.1B 保存液（Reagent B） 毫升 GMS16038.1C 缓冲液（Reagent C） 毫升 GMS16038.1D 反应液（Reagent D） 毫升 GMS16038.1E 底物液（Reagent E） 毫升 GMS16038.1F 阴性液（Reagent F） 毫升 GMS16038.1G 显色液（Reagent G） 毫升 GMS30030.1 Bradford 蛋白质浓度定量试剂盒 200 次 试剂盒订购信息 产品编号 名称 规格 GMS16038.1 植物果胶甲酯酶（pectin methylesterase；PME）活性比色法定量检测试剂盒 20 次 GMS16038.2 真菌果胶甲酯酶（pectin methylesterase；PME）活性比色法定量检测试剂盒 20 次 GMS16038.3 细菌果胶甲酯酶（pectin methylesterase；PME）活性比色法定量检测试剂盒 20 次 GMS16039.1 植物果胶甲酯酶（pectin methylesterase；PME）活性荧光定量检测试剂盒 20 次 GMS16039.2 真菌果胶甲酯酶（pectin methylesterase；PME）活性荧光定量检测试剂盒 20 次 GMS16039.3 细菌果胶甲酯酶（pectin methylesterase；PME）活性荧光定量检测试剂盒 20 次