1.试剂和材料
H9细胞完全培养基试剂盒

成分                                    规格       数量    储存条件
H9细胞基础培养基            500mL     1瓶         2-8℃
H9细胞培养基添加剂        20mL        1支        -20℃

所需的其它试剂和材料
产品                                规格
Y27632                           1mg     
Matrigel                           5mL
H9细胞消化液                 500mL    
ES细胞专用冻存液         100mL    

2.培养流程
2.1试剂的制备
2.1.1 完全培养基制备
2.1.1在室温（15-25℃)  或冰箱内（2-8℃)  过夜解冻细胞培养基添加剂 ，可在无菌条件下将添加剂分装为适量的工作等份 ，并在-20℃下冻存。冷冻的分量须在3个月内用完。解冻后的分量应该一天内制备成完全培养基。请勿在解冻后再次冷冻。
2.1.2.在无菌条件下将20mL的添加剂全部解冻后加入到500mL的基础培养基中 ，充分混匀。完全培养基在（2-8℃)下储存时刻维持稳定状态最多2-3周 ，或在-20℃下冷冻时刻维持稳定状态最多3个月。在室温（15-25℃)  或冰箱内（2-8℃)  过夜解冻冷冻的培养基 ，不要长时间放在37℃水浴内加热培养基。
如果在无菌条件下制备 ，细胞完全培养基可直接使用。

2.1.2 Matrigel工作液的配制与包被
鉴于基质胶的操作环境要求比较严格 ，为保证您的实验顺利 ，特此对以下几个方面进行温馨提示：
1. 收货时 ，首先确认还有干冰 ， Matrigel成固态 ，液面水平 ，如有异常请及时拍照取证并联系我们。
2. 整个Matrigel只能分装一次 ，在分装前 ，要先放4℃冰箱（最好先把Matrigel插在冰上 ，然后放入4℃冰箱）过夜 ，且分装用的枪头、 EP管等都要提前-20℃预冷（基质胶在10℃以上会发成胶凝固导致基质胶报废） ，整个分装过程都需在冰上进行 ，且以后每次试验时拿出本次用量所需的基质胶。
3. 实验人员手心不要接触基质胶 ，如 ：要手持装有Matrigel的EP管的上方 ，防止体温使基质胶成胶凝固。
4. Matrigel的稀释比例建议为100倍稀释。

本库建议的配制Matrigel工作液方法：
1. 稀释前将Matrigel放入4℃冰箱过夜融化。
2. 将适量体积的稀释液（DMEM/F12或PBS）置4℃冰箱预冷。
3. 将融化的Matrigel与稀释液从冰箱中取出并打开盖子 ，用移液管吹吸稀释液几次以冷却移液管 ，并吸取少量稀释液加入Matrigel管中混匀 ，将Matrigel转移到稀释液中 ，并吹打混匀。（因为Matrigel遇15℃以上温度就会成凝胶粘在原装玻璃壁和移液管壁上 ，故Matrigel从冰箱拿出来以后尽快打开盖子并转移到预冷的稀释液中 ， 吸取Matrigel的移液管一定要冷却）。
4. 立即用稀释后的Matrigel包被培养板或培养皿。对于6孔板 ，每个孔使用1mL稀释后的Matrigel ，对于6cm的培养皿 ，每个孔使用2mL稀释后的Matrigel ，晃动培养板使Matrigel溶液均匀的分布在表面上。
5. 使用前 ，包被的培养板应放在培养箱（37℃)  下至少1h。请勿让培养板脱水。在培养板可供使用之前 ，请勿移除Matrigel溶液。
如果不立即使用 ，培养板必须密封 ，以防止脱水。包被后的培养板可在2-8℃下最多储存7天。
如果Matrigel溶液并未完全覆盖表面 ，则无法实验最佳的细胞培养 ， 因此 ，不建议使用含有溶液已蒸发区域的培养板。
如果已将培养板在2-8℃下储存 ，则在移除Matrigel溶液之前 ，将培养板在培养箱（37℃)  下放置30min。

2.1.3 Y27632的配制
Y27632粉末溶解在PBS中 ，配制成浓度未10mM的储存液 ，0.22μm滤膜过滤除菌。分装后冷冻于-20℃。
Y27632提高复苏和传代后的克隆形成率 ，所以只在复苏和传代步骤添加（1:1000 ，即终浓度为10μM） ，换液时不添加。

2.1.复苏
在开始复苏前 ，将所有试管、预热后的培养基和培养皿准备好 ， 已确保尽快完成复苏过程。
1. 将冻存管从液氮中取出 ，快速在37℃水浴槽中解冻 ，轻柔持续地摇动冻存管 ，直到只剩下一个小冷冻团。从水浴槽取出冻存管 ，70%乙醇擦拭进行消毒。
2. 使用移液管将冻存管中含有H9细胞的冻存液轻轻转移至一个含有5-6mL已经预热的完全培养基的15mL离心管中 ，过程必须轻柔防止吹散细胞团。
3. 室温300g离心5min。
4. 吸出培养基 ，确保细胞团完整。
5. 然后缓慢加入1mL完全培养基 ，用手指轻弹离心管底部 ，使细胞团脱离底部并分散。
6. 轻轻的将此1mL细胞悬液转移至已包被的培养皿/板/瓶 ，根据最终培养细胞的液体体积 ，加入ROCK inhibitor Y27632 ，终浓度为10μM。
7. 将培养皿/板/瓶置于37℃培养箱中 ，每天更换培养基（换液不需要再添加Y27632 ，但培养基需提前预热）。

2.2.传代
当集落变得较大、 中心变得密集、 明亮（对比边缘） ，相邻的集落开始融合时 ，此时可进行传代。
1. 传代前 ，准备37 ℃预热好的无钙镁 PBS 溶液及消化液 ，完全培养基。
2. 吸走上清 ，并加入37℃预热好的PBS 溶液清洗1次。
3. 加入适量（按 6 孔板每孔加 1mL ，6cm 皿加 2mL ， 10cm 皿加 3mL 的量） 的 37℃预热好的消化液。
4. 37℃放置1-2min ，用手指轻弹皿/板/瓶身 ，显微镜下观察到大部分克隆边缘开始脱离培养皿/板底 ，克隆内部大部分细胞成团脱落。
5. 加入适量的完全培养基终止消化。
6. 移入离心管 ， 300g离心5min。
7. 离心后重悬（重悬步骤参照复苏4-5步）。
8. 传代比例为 1 ：6—1 ：8 ，根据最终培养细胞的液体体积 ，加入ROCK inhibitor Y27632 ，终浓度为10μM。
9. 将培养皿/板/瓶置于37℃培养箱中 ，每天更换培养基（换液不需要再添加Y27632 ，但培养基需提前预热）。

2.3.冻存
当集落变得较大、 中心变得密集、 明亮（对比边缘） ，相邻的集落开始融合时 ，此时可进行传代。
1. 传代前 ，准备 37 ℃预热好的无钙镁 PBS 溶液及消化液 ，完全培养基。
2. 吸走上清 ，并加入 37℃预热好的 PBS 溶液清洗1次。
3. 加入适量（按 6 孔板每孔加 1mL ，6cm 皿加 2mL ， 10cm 皿加 3mL 的量） 的 37℃预热好的消化液。
4. 37℃放置1-2min ，用手指轻弹皿/板/瓶身 ，显微镜下观察到大部分克隆边缘开始脱离培养皿/板底 ，克隆内部大部分细胞成团脱落。
5. 加入适量的完全培养基终止消化。
6. 移入离心管 ， 300g离心5min。
7. 离心后重悬（重悬步骤参照复苏4-5步）。
8. 使用预冷的冻存液轻轻的重悬细胞团 ，然后将细胞悬液转移至冻存管 ，冻存按 6 孔板每孔冻 1 支 ， 6cm 皿冻2-4 支 ， 10cm 皿冻 6-12 支。