elisa试剂盒的各种样品该怎么处理
点击次数:1017次 发布时间:2019/7/16 8:45:37
1.细胞培养物上清:
细胞培养物于室温1000g,离心10分钟后收集上清,并将标本保存于-20℃,且应避免反复冻融。
2.血清:
标本请于室温放置2小时或4℃过夜后于1000g,4℃离心20分钟,取上清即可检测,或将标本放于-20℃保存,但应避免反复冻融。
3.血浆:
可用EDTA或肝素作为抗凝剂标本采集后30分钟内于2-8℃,1000g离心15分钟,或将标本放于-20℃保存,但应避免反复冻融。
4.尿液:
无菌收集取初尿,离心除去沉淀物,即可用于检测,要长期保存尿样,可以加入0.05%的NaN3在4-8℃保存,或加入尿样冰冻保护液放入-20℃冰箱长期保存。
5.组织匀浆:
将组织标本先用PBS洗涤,除去多余血液,匀浆化后放在PBS于-20℃放置过夜,再经过二次反复冻融破膜,5000g,4℃离心5分钟,取上清即可检测。
ELISA法定量检测人细胞液、体液以及组织匀浆中8羟基脱氧鸟苷的含量。
试剂组成:包被平底微孔板,酶结合物,生物素,标准品,显色剂A,显色剂B,终止液,浓缩洗涤液(100倍稀释),使用说明书
自备物品
1.酶标仪(尽量提前预热)
2.微量加液器、吸头
3.蒸馏水或去离子水以及滤纸
样本的采集及保存
一般的生物标本包括有:
血液、体液、内脏器官、粪便、胃液、活检组织、组织提取液、天然孔分泌物及各种表达系统的表达产物等
一般为无菌操作,低温保存(-80℃、液氮)
一.如果采集的实质器官则要求:
1、器官实质不能太小
2、以采集实质性病灶区为佳:如淋巴结、心脏、非、肺、脾以及肠管等病毒、病菌聚集的地方为佳
3、同一病例装入同一容器,并做好标记
4、应在0-8℃的低温储存和运输
5、实质性器官的处理:
5.1、取实质性器官约0.5mg左右,充分剪碎或研磨
5.2、加入约500ul的PBS/生理盐水,充分混匀
5.3、离心5000rmp x10min,去上清
5.4、-20℃保存,作为待检标本(切勿反复冻融)
二.体液(常见的包括血清、血浆、唾液以及尿液等)的处理方式
1、血液包括血浆和血清,它们的主要区别就是:血清凝血而血浆不凝血,所以它们的处理方式也就不一样
1.1、采集血浆时一般不加抗凝剂(主要为枸橼酸盐和柠檬酸盐),采集后立即离心800-1000rmp x 5min分离,取上清,-20℃或4℃保存备用;
1.2、如要采集血清,一般要加入总体积1%的抗凝剂,采集后先室温或4℃静置半小时后,800-1000rmp x 5min分离,取上清,-20℃或4℃保存备用;
2、胃液和唾液的采集方式一般现采现用,但是一般饭后半小时内不易采集,因为刚进食的唾液中富含丰富的唾液淀粉酶,最好的采集的时间时空腹采集;
3、尿液的采集方式基本和唾液一样的,即现采现用,但是一般隔夜尿不采集;
4、组织提取液如肺泡灌洗液等,采集后离心分离,800-1000rmp x 5min,取上清,-20℃或4℃保存备用;
三.粪便以及天然孔排泄物:采集后一般现用PBS/生理盐水溶解,充分混匀,800-1000rmp x 5min分离,取上清,-20℃或4℃保存备用;
四.活检组织一般进行穿刺检测,最常见的就是肝活检,像病毒性肝炎、脂肪肝、各种类型的肝硬化等进行活检简单方便、准确。
三、表达产物的检测
(一)真核表达产物
1、细胞上清(分泌性蛋白)
1.2、贴壁细胞或半贴壁,直接将细胞培养上清吸出,10000rmp x10min, 取上清,-20℃或4℃保存,作为标本进行检测,如有需要可进行透析或纯化处理;
1.2、不贴壁细胞,将培养基和细胞转移至10ml离心管,500-800rmp x10min,吸取上清至另一10ml离心管中,10000rmp x10min, -20℃或4℃保存,作为标本进行检测,如有需要可进行透析或纯化处理;
2、细胞裂解物(非分泌性蛋白)
2.1、贴壁细胞或半贴壁,直接将细胞培养上清吸出,然后用001M PBS(pH 7.4)将细胞吹下至10ml离心管,500-800rmp x10min,弃上清,沉淀转移至1.5ml离心管中, DDW重悬,置冰水浴中用超声波裂解仪进行裂解,10000rmp x10min,取上清,-20℃或4℃保存,作为标本进行检测,如有需要可进行透析或纯化处理;
2.2、不贴壁细胞,将培养基和细胞转移至10ml离心管,500-800rmp x10min,弃上清,沉淀移至另一10ml离心管中,0.01M PBS(pH 7.4)重悬,500-800rmp x10min,弃上清,沉淀移至1.5ml离心管中, DDW重悬,置冰水浴中用超声波裂解仪进行裂解,10000rmp x10min,取上清, -20℃或4℃保存,作为标本进行检测,如有需要可进行透析或纯化处理;
(二)原核(大肠杆菌表达系统)表达产物
1、表达上清(非融合性蛋白)
直接将培养物和上清吸出,10000rmp x10min, 取上清,-20℃或4℃保存,作为标本进行检测,如有需要可进行透析或纯化处理;
2、菌体裂解物(融合性蛋白)
直接将培养物和上清吸出,10000rmp x10min,弃上清,沉淀用PBS洗一遍,500-800rmp x10min,弃上清,DDW重悬沉淀,冰水浴中用超声波裂解仪进行裂解,10000rmp x10min,取上清,-20℃或4℃保存,作为标本进行检测,如有需要可进行透析或纯化处理;
注意事项
1.试剂准备:所有试剂都必须在使用前达到室温,使用后请立即按照说明书要求保存。实验操作中必须使用一次性吸头,避免交叉污染。
2.加样:加样时,要控制加样速度,避免第一孔与最后一孔之见的时间间隔过大,否则将会导致不同的预孵育时间,从而影响实验的准确性以及重复性;一般加样时间控制在10分钟内,如果样本数量过多,可使用多道移液器。
3.孵育:样品要在密闭的容器内进行孵育,严格按照说明书上规定的孵育时间和温度进行。
4.洗涤:洗涤过程中反应孔中的残留的洗涤液应在滤纸上充分拍干,同时要消除板底残留的液体和手指痕迹,避免影响最后的酶标仪读数。
5.反应时间的控制:加入底物后请定时观察反应孔的颜色变化(比如,10分钟左右),如果颜色较深,请提前加入终止液终止反应。
6.建议实验前预测样品含量,如样品浓度过高,应对样品进行稀释,计算结果时乘以相应的稀释倍数。
7.建议使用本试剂盒时先做预实验(即先做标准曲线,试用几个标本),如果对本试剂盒有任何疑问,可和所购经销商联系,如果因运输过程导致试剂盒失效,可要求调换,但概不承担产品本身以外的任何损失。
操作步骤
1.取出试剂盒,于室温(20-25℃)放置15-30分钟。实验过程应在室温(20-25℃)内进行。
2.取出酶标板,按照标准品的次序分别加入50μl的标准品溶液于空白微孔中。
3.空白微孔中加入50μl的样品,空白对照加入50μl的蒸馏水;
4.在样品孔中加入10μl的生物素;(不含空白对照孔,切忌:生物素只加样品孔!)
5.在各孔中加入100μl的酶标记溶液;(不含空白对照孔)
6.将酶标板用封口胶密封后,37℃孵育反应 1小时;(在孵育箱中保持稳定的温度与湿度)
7.充分清洗酶标板3-5次,保持各孔有充足的水压;(浓缩洗涤液以1:100的比例与蒸馏水稀释)
8.酶标板洗涤后用吸水纸彻底拍干;
9.各孔加入显色剂A、B液各50μl;(不含空白对照孔)
10.20-25℃下避光反应15分钟;
11.各孔加入50μl终止液,终止反应;
结果判断
1.30分钟内在波长450nm的酶标仪上读取各孔的OD值;
2.以OD值为纵坐标,以标准品的浓度为横坐标,绘制曲线图;
3.根据样品的OD值查找对应的浓度范围;
4.敏感度:0.1 ng/ml