CAT#:JW-211206-150
常温运输及保存，有三个低温成分

DNA甲基化修饰试剂盒（凝胶法）

产品及特点
DNA甲基化分析中的关键步骤是亚硫酸氢盐修饰DNA，此反应要求DNA必须处于单链状态，反应还必须在低温进行。由于常规的修饰反应都在液相进行，在低温下让液相中的DNA保持单链状态非常棘手，故修饰效率很低。此外，修饰反应要多次切换反应液，有多个沉淀步骤，故DNA回收率一般都不高于50%。为克服这些缺点，本公司开发出了此产品，它具有下列特点：
1．用包埋的DNA进行所有操作，免去所有沉淀和纯化步骤，极大简化了操作。
2．免去了DNA提取过程，所需实验材料更少，最少几个细胞都可以，极大地节约了宝贵材料，尤其适用于珍稀材料。
3．包埋中的DNA在整个操作过程中都处于单链状态，提高了修饰效率。
4．DNA包埋在包埋块中，切换反应液不但非常方便，而且DNA回收率都在90%以上。
5．既适用于实体材料和悬浮细胞，也适用于纯化好的DNA样品。
6．本试剂盒足够制备150多个10uL包埋块（如果用纯化好的DNA）或25个10uL包埋块（如果用悬浮细胞）。

规格及成分
成分                                        产品编号          规格                包装材料
DNA甲基化修饰溶液    A         211206a          30 mL          30 mL本色瓶
包埋液                                      211206b         1.5 mL          2.0 mL蓝盖、低温成分
包埋块裂解液                           220985a         12.5 mL        15 mL低温成分
分子生物学级石蜡油                220101            25 mL          30 mL本色瓶
蛋白酶K溶液（10mg/mL）       220137           150 uL          2.0 mL红盖，低温成分
DNA甲基化修饰溶液B成分一    211206b1        2.3 g×5        5mL本色瓶
DNA甲基化修饰溶液B成分二    211206b2        110 mg×5     1.5mL棕色离心管
TE缓冲液，pH 8.0                     220138           125 mL        125 mL本色瓶
使用手册                                    211206sc        1份                        无
本产品使用小扁盒包装

自备试剂
超纯水

运输及保存
常温运输及保存。蛋白酶K溶液（10mg/mL）、包埋液、包埋块裂解液需低温运输，-20℃保存。有效期一年。

使用方法
一、准备试剂
1.在装有2.3g 天净沙甲基化修饰溶液B成分一干粉的棕色瓶中加入3.9 mL水和0.9 mL天净沙甲基化修饰溶液A，摇晃溶解得到4.8 mL溶液B成分一。
2.在装有110mg溶液B成分二干粉的离心管中加入1 mL 50℃预热的超纯水，摇晃溶解，得到溶液B成分二。
3.将0.6 mL溶液B成分二加入到4.8 mL溶液B成分一中，得到5.4 mL溶液B工作液，冰上放置待用。未用完的溶液B工作液不得再使用。
4.每次实验前，将装有1.5 mL包埋液的离心管在沸水浴上放置数分钟直到变成溶液，然后放80℃待用。

二、对微量组织材料（如果材料足够，可先纯化DNA，再直接进入第三步）
5.用常规的胰酶消化法处理动物实体组织或培养细胞，得到浓度不超过60个细胞/uL的单细胞PBS悬液。如果实验材料已经是单细胞悬浮液（如卵细胞），则PBS洗涤后直接离心沉淀，再重悬在PBS中（浓度不超过60个细胞/uL）。注：本试剂盒不含本步所需相关试剂，如胰酶消化液和PBS。
6.在一个自备的2 mL离心管中加入3 uL上步所得细胞悬液，再迅速滴加7 uL在 80℃预热的包埋液，共得10uL包埋液-细胞混合液。注：不需要吹打混匀以免混合液在抢头里面凝固。
7.加入500 uL分子生物学级石蜡油确保后续处理过程中溶液不会蒸发。短暂离心确保10uL包埋液-细胞混合液沉到管底。
8.将离心管在沸冰浴中放20分，此步可将DNA分子变性成单链。
9.将离心管转移到冰上放置30分钟，包埋液-细胞混合液将凝固成10uL的包埋块，包埋块中将包含细胞的基因组DNA和蛋白质组份。
10.在包埋块中加入500 uL包埋块裂解液和5 uL蛋白酶K溶液（10mg/mL），短暂离心后37℃保温过夜。此步将降解包埋块中的蛋白质组份。
11.吸弃包埋块之外的所有溶液（包括石蜡油）后，分别用1mL TE缓冲液室温浸泡包埋块2次，每次15分钟。此步可去除残留在包埋块中的裂解液和蛋白酶K。
12.酶切包埋块中的基因组DNA：选定不识别PCR靶片段的内切酶（本试剂不提供该试剂），再用此酶对应的100 uL 1×酶切缓冲室温液浸泡包埋块15分钟，吸弃该缓冲液后再加入100 uL1×酶切缓冲和50U选的的内切酶，37℃保温2小时后吸弃内切酶反应液。
13.加入500uL新鲜配制的处理液A，室温放置15分钟后吸弃处理液A。处理液A配制方法：100 uL DNA甲基化修饰溶液A +400 uL超纯水。
14.重复上步一次。此时DNA将呈单链。
15.加入1 mL新鲜配制的处理液B（不是溶液B），室温浸泡包埋块5分钟后吸弃处理液B。处理液B配制方法：50uL DNA甲基化修饰溶液A +950 uL超纯水。
16.加入750uL石蜡油，然后沸水浴30秒，使DNA变性。
17.将离心管转移到冰上放置30分钟使包埋块重新凝固，单链DNA将固化。
18.在离心管中加入1mL在第3步预冷的溶液B工作液，短暂离心后继续在冰上放置30分钟。此步用于修饰固化的单链DNA。
19.将离心管转移到50℃放置3.5小时后吸弃溶液B工作液。
20.分别用1mL TE缓冲液常温洗涤包埋块2次，每次15分钟，吸弃TE缓冲液。
21.分别用500 uL新鲜配制的处理液C（50 uL DNA甲基化修饰溶液A +450 uL超纯水）常温洗涤包埋块2次，每次15分钟，然后吸弃处理液C。
22.用1 mL TE缓冲液常温洗涤包埋块3次，每次10分钟，然后吸弃TE缓冲液。
23.所得包埋块可以在4℃保存数月待用，也可以用超纯水洗涤两次（每次15分钟）后直接用做100uL体系甲基化PCR的模板。

三、对纯化好的DNA溶液
24.如果样本是纯化好的DNA溶液，先用不识别PCR靶片段的合适内切酶酶切DNA，总体积不超过20uL，DNA不超过700 ng。本试剂盒不提供所需内切酶。
25.酶切结束后，沸水浴10分钟灭活内切酶并变性DNA。
26.冰上放置并短暂离心数秒后，再加入4 uL DNA甲基化修饰溶液A，50℃保温15分钟。
27.迅速加入50 uL在80℃预热的包埋液，用手指快速弹击管底混匀溶液并继续放80℃待用。不要吹打混匀以避免包埋液在移液枪头中凝固。
28.在一个新的2 mL离心管中，加入1 mL第3步预冷的溶液B工作液，再加上750 uL石蜡油，短暂离心后将离心管放冰上预冷。
29.迅速取80℃保温的混合液10uL（第27步），用在空中滴加的方式加到第28步准备的预冷离心管中，滴加的混合液遇冷将迅速在石蜡油中形成一个包埋块。注意：不要将枪头浸入到预冷的溶液中，否则包埋液将迅速在枪头内凝固。如果包埋块没有沉到管底，可以用枪头将其拨到石蜡层下面的液相中。
30.再重复上步操作6次，共可以得到7个包埋块（每块约含100ng DNA）。
31.将离心管（含7个包埋块）继续放冰上30分钟进行修饰。
32.后续操作同第19-23步。

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