CAT#:JW-15-59300
低温运输，-20℃保存

新城疫病毒探针法qRT-PCR试剂盒

产品及特点
新城疫病毒(Newcastle Disease Virus, NDV)，也叫禽副粘病毒1型，属于副黏病毒科禽副黏病毒属。新城疫病毒是ssRNA病毒，有包膜，病毒颗粒具多形性，有圆形、椭圆形和长杆状等，成熟的病毒粒子直径100～400nm。新城疫病毒对外界环境的抵抗力较强，55℃作用45min和直射阳光下作用30min才被灭活。病毒在4℃中存放几周，在-20℃中存放几个月或在-70℃中存放几年，其感染力均不受影响。新城疫是由新城疫病毒中强毒株引起禽的一种高度接触性染病，以高热、呼吸困难、下痢、神经紊乱、黏膜和浆膜出血为特征，具有很高的发病率和病死率，是危害养禽业的一种主要传染病。世界动物卫生组织将其列为法定报告疫病，我国将其列为一类进境动物疫病。因此对新城疫病毒的快速灵敏诊断具有重要意义。本产品以探针法荧光定量RT-PCR技术为基础开发的专门检测新城疫病毒的试剂盒，它具有下列特点：
1.即开即用，用户只需要提供样品RNA模板。
2.引物和探针经过优化，分析灵敏性高，可以达到100拷贝/μL。
3.提供阳性对照，便于区分假阴性样品。
4.特异性高，引物是根据新城疫病毒RNA高度保守区设计，不会跟其他的RNA发生交叉反应。
5.既可用于定性检测，又可用于定量检测。用于定量检测时线性范围至少为5个数量级。
6.本产品足够50次20μL体系的探针法qRT-PCR反应。
7.本产品只能用于科研。

规格及成分
本产品采用五孔盒包装
成分                                                                           编号            规格        包装
探针法RT-PCR缓冲液                                           990504a        0.5 mL    0.5 mL蓝盖管
探针法RT-PCR酶混合液v2                                   990504bv2     50 μL     0.5 mL红盖管
荧光PCR模板专用稀释液                                      180701          1 mL      1.5 mL绿盖管
超纯水                                                                   210806           1 mL     1.5 mL蓝盖管
新城疫病毒qRT-PCR引物-探针干粉                      yp15-59300    50 次    1.5 mL棕色管
新城疫病毒qRT-PCR阳性对照(1×10E7拷贝/μL)    pc59300        50 μL    0.5 mL黄盖管
使用手册                                                                15-59300sc    1份                无
注意：引物-探针干粉在使用前需要短暂离心，然后在离心管中加入162uL的超纯水充分混匀后再使用，未用完的需要-20℃保存。

运输及保存
低温运输，-20℃保存，保存期限为12个月。

自备试剂
样品RNA，超纯水。

使用方法
一、稀释标准曲线样品（以10E1-10E6拷贝/μL这6个10倍稀释度为例）。由于标准品浓度非常高，因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行，千万不能污染样品或本试剂盒的其他成分）。为增加产品稳定性和避免扩散传染性病原，本产品不提供活体样品做阳性对照，只提供无传染性的DNA片段作为阳性对照。
1.标记6个离心管，分别为6，5，4，3，2，1。
2.用带芯枪头分别加入45μL荧光PCR专用模板稀释液，最好用带芯枪头，下同）。
3.在6号管中加入5μL1×10E7拷贝/μL的阳性对照(试剂盒提供)，充分震荡1分钟，得1×10E6拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。
4.换枪头，在5号管中加入5μL1×10E6拷贝/μL的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡1分钟，得1×10E5拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。
5.换枪头，在4号管中加入5μL1×10E5拷贝/μL的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡1分钟，得1×10E4拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。
6.重复上面的操作直到得到6稀释度的标准曲线样品。放冰上待用。

二、样品RNA的制备
7.如果有N个样品，最好设置N+2个提取，多出的一个是样品制备PC（样品制备阳性对照），一个是样品制备NC（样品制备阴性对照）。可以用10μL阳性对照的10000倍稀释液再加上一定量的水使总体积跟每次制备要求的体积一样，以此作为样品制备PC。另外用水作为样品制备NC。
8.用自选方法纯化样品的RNA，本试剂盒跟市场上大多数病毒RNA提取试剂盒兼容。
三、设置qRT-PCR反应（20μL体系，在样品制备室进行）
9.如果做定量分析并且只做1次重复，则标记N+9个PCR管，其中N+2个用于上步得到的N+2个样品，1个用于PCR阴性对照（用水做模板），5个用于标准曲线。如果做定性分析，并且只做1次重复，则标记N+4个PCR管，其中N+2个用于上步得到的N+2个样品，1个用于PCR阴性对照（用水做模板），1个用于PCR阳性对照（用试剂盒提供的阳性对照的10000倍稀释液做模板）。下面只以定量分析为例描述操作步骤。
10.在标记管中按下表加入各成分（本表只列出一次重复。样品管和阴性对照设置完毕后才设置阳性对照，并且阳性对照样品要等所有管子盖上盖子储存好后最后加）：

成分                                                    样品管N+2个    PCR阴性对照管    标准曲线样品管（1-6管）
探针法qRT-PCR缓冲液                                  10μL        10μL                           各10μL
探针法qRT-PCR酶混合液                                2μL           2μL                          各2μL
新城疫病毒探针法qRT-PCR引物-探针混合液    3μL        3μL                           各3μL
N+2个待测RNA模板                                          5μL        不加                           不加
超纯水                                                               不加        5μL                           不加
第6步所得标准曲线样品稀释液（2-6号）          不加       不加    各5μL（1号样到1号管，2号样到2号管…）
11.盖上盖子后上机，按下面参数进行RT-PCR：
过程                温度    时间
逆转录             50℃    15 min
预变性             95℃    5 min
PCR反应
（40个循环）    95℃    15sec
                            60℃    60sec（采集FAM通道的荧光信号，淬灭基团为BHQ1）

四、数据处理
12.如果扩增阳性对照或制备阳性对照结果为阴性，则整个扩增或制备实验无效，不需要分析数据，需要重做扩增或制备或跟厂家联系。如果扩增阴性对照或制备阴性对照结果为阳性，说明环境污染，则整个扩增或制备实验无效，不需要分析数据，需要跟厂家联系，购买新的引物和探针。
13.如果阴性对照和阳性对照正常，则实验有效，可以进入后续分析。
14.如果把本试剂盒用于定量检测，则以阳性对照浓度的log值为横轴，以Ct值为纵轴，绘制标准曲线。再以待测样品的Ct值从标准曲线上推算出样品RNA浓度的log值，再推算出其浓度。
15.如果把本试剂盒用于定性检测，只判断阳性或阴性，则阴性对照必须无Ct或Ct大于或等于35。阳性对照必须有荧光对数增长，有典型扩增曲线，Ct值应该小于35，否则实验无效。如果实验有效，则分析待测样品，如果无Ct或Ct大于或等于35，则为阴性。如果Ct小于35则为阳性。

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