CAT#:JW-15-15951
低温运输，-20℃保存

禽流感病毒H5/H7新城疫病毒三重探针法qRT-PCR试剂盒

产品及特点
禽流感病毒（Influenza A Virus）即甲型流感病毒，属单股负链RNA病毒。
该病毒感染禽类且容易在鸟类间流行，过去在民间称为“鸡瘟”，国际兽疫局将其定为甲类传染病，其中H5和H7型为高致病性毒株可造成急性禽流感。又称欧洲鸡瘟，主要发生于鸡和火鸡，常突然爆发，无先兆症状就突然死亡，死亡率50%～100%。新城疫病毒(Newcastle Disease Virus，NDV）属单股负链RNA病毒。该病毒主要危害鸡、珠鸡和火鸡，在被侵袭的鸡群中迅速传播，强毒株可使鸡群全群毁灭。弱毒株仅引起鸡群呼吸道感染和产蛋量下降，但可迅速康复。禽流感病毒H5、H7型及新城疫病毒严重影响禽类健康造成养殖业的损失，因此快速检测禽流感病毒H5、H7型及新城疫病毒具有重要的意义。本产品就是以探针法qRT-PCR技术为基础开发的同时检测禽流感病毒H5、H7型及新城疫病毒的试剂盒，它具有下列特点：
1.即开即用，用户只需要提供样品RNA模板。
2.引物和探针经过优化，分析灵敏性高，可以达到100拷贝/反应。
3.提供阳性对照，便于排除假阴性结果。
4.特异性高，引物和探针分别根据禽流感病毒RNA H5型、H7型以及新城疫病毒RNA高度保守区设计，不会跟其他生物的RNA发生交叉反应。
5.既可用于定性检测，又可用于定量检测。用于定量检测时线性范围至少为4
个数量级。
6.禽流感病毒H5型、H7型及新城疫病毒分别用FAM、ROX和HEX标记的三个探针检测。
7.本产品足够50次20μL体系的探针法RT-PCR反应。
8.本产品只能用于科研。

规格及成分
本产品使用十孔盒包装
成分                                                                                                   编号           规格        包装
探针法RT-PCR缓冲液                                                                990504a            500 μL    0.5mL蓝盖管
探针法RT-PCR酶混合液 v2                                                        990504bv2        100 μL    0.5mL红盖管
荧光PCR专用模板稀释液                                                            180701           1 mL       1.5mL绿盖管
禽流感病毒H5/H7型及新城疫病毒三重RT-PCR引物-探针干粉    Yp15-15951    50次       0.5mL棕色管
禽流感病毒H5型阳性对照（1×10E7拷贝/μL）                            Pc15950        50 μL       0.5mL棕色管
禽流感病毒H7型阳性对照（1×10E7拷贝/μL）                           Pc15970        50 μL        0.5mL棕色管
新城疫病毒阳性对照（1×10E7拷贝/μL）                                    Pc59300       50 μL       0.5mL黄盖管
使用手册                                                                                    15-15951sc    1份                无
注意：在使用前需要短暂离心引物-探针干粉管，然后在离心管中加入220uL的超纯水充分混匀后再使用，未用完的需要-20℃保存

运输及保存
低温运输，-20℃保存，保存期限为12个月。

自备物品
样品RNA。

使用方法
一、稀释禽流感病毒H5型标准曲线样品（以10E1-10E6拷贝/μL这6个10倍稀释度为例）由于标准品浓度非常高，因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行，千万不能污染样品或本试剂盒的其他成分）。为增加产品稳定性和避免扩散传染性病原，本产品不提供活体样品做阳性对照，只提供无传染性的DNA片段作为阳性对照。
1.1.标记6个离心管，分别为A6，A5，A4，A3，A2，A1。
2.用带芯枪头分别加入45μL荧光PCR专用模板稀释液，最好用带芯枪头，
下同）。
3.在6号管中加入5μL1×10E7拷贝/μL的阳性对照(试剂盒提供)，充分震荡1分钟，得1×10E6拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。
4.换枪头，在5号管中加入5μL1×10E6拷贝/μL的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡1分钟，得1×10E5拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。
5.换枪头，在4号管中加入5μL1×10E5拷贝/μL的阳性对照(上步所得)，充分震荡1分钟，得1×10E4拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。
6.重复上面的操作得到A1-A6共六个稀释度标准曲线阳性样品。放冰上待用。

二、稀释禽流感病毒H7型检测标准曲线样品
7.操作同上，只是使用试剂盒提供禽流感病毒H7型阳性对照作为模板。得到6个浓度的样本放冰上待用，分别是B1-B6。

三、稀释新城疫病毒检测标准曲线样品
8.操作同上，只是使用试剂盒新城疫病毒阳性对照作为模板。得到6个浓度的样本放冰上待用，分别是C1-C6。
四、样品RNA的制备
9.如果有N个样品，最好设置N+4个提取，多出的3个是禽流感病毒H5型/H7型及新城疫病毒的PC（样品制备阳性对照），一个是NC（样品制备阴性对照）。可以用自备的、确定是阳性的样本作为样品制备阳性对照，可以用自备的、确定是阴性的样本作为样品制备阴性对照，可以用水替代。
10.用自选方法纯化样品的RNA（含内参），本试剂盒跟市场上大多数RNA提取试剂盒兼容。
五、Probe RT-PCR反应（20μL体系，在样品制备室进行）
11.如果有N+2个核酸提取，则设置N+3个RT-PCR反应，多出的一个是扩增阴性对照。再根据需要做1-3个标曲，每个标曲需要6个反应。下表只是以做1个N基因的标曲为例。如果还要做S和E基因的标曲，请参考下表再各设置6各标曲反应：
成分                                                                样品管N+2个    RT-PCR阴性对照    标曲样品管（A1-A6）
探针法qRT-PCR缓冲液                                       各10 μL        10 μL                        各10 μL
探针法qRT-PCR酶混合液 v2                               各2 μL            2 μL                       各2 μL
禽流感病毒H5/H7型及新城疫病毒三重RT-PCR引物-探针混合液    各4 μL    4 μL    各4 μL
N+2个待测RNA                                                   各4 μL            不加                        不加
超纯水                                                                不加                4 μL                        不加
第一步所得标准曲线样品稀释液（A1-A6号）    不加               不加       各4μL（A1号样到A1号管，A2号样到A2号管…）
12.盖上盖子后上机，按下面参数进行RT-PCR：
过程                    温度    时间
逆转录                50℃    15 min
预变性                95℃    10 min
PCR反应
（45个循环）    94℃    30 sec
                          60℃    60 sec（采集FAM通道、ROX通道和HEX通道的荧光信号，淬灭基团均为TAMRA）

六、数据处理
13.如果所有标曲扩增或制备阳性对照结果为阴性，则整个扩增或制备实验无效，不需要分析数据，需要重做扩增或制备或跟厂家联系。如果扩增阴性对照或制备阴性对照结果为阳性，说明环境污染，则整个扩增或制备实验无效，不需要分析数据，需要跟厂家联系，购买新的引物和探针。
14.如果阴性对照和阳性对照正常，则实验有效，可以进入后续分析。
15.如果把本试剂盒用于定量检测，则以阳性对照浓度的log值为横轴，分别以阳性对照（FAM通道、HEX通道和ROX通道）的Ct值为纵轴，绘制标准曲线，阳性对照的标准曲线为斜线，r2必须大于0.95。再以待测样品的Ct值从阳性对照的标准曲线上推算出样品RNA浓度的log值，再推算出其浓度。
16.对定性检测，只判断阳性或阴性，则阴性对照FAM、ROX及HEX通道的Ct必须大于或等于40。禽流感病毒H5型阳性对照FAM通道的荧光信号必须有对数增长，有典型扩增曲线，Ct值应该小于或等于35。对待测样品，如果其FAM通道的Ct大于或等于40则为禽流感病毒H5型阴性，如果小于或等于35则为禽流感病毒H5型阳性。禽流感病毒H7型阳性对照ROX通道的荧光信号必须有对数增长，有典型扩增曲线，Ct值应该小于或等于35。对待测样品，如果其ROX通道的Ct大于或等于40则为禽流感病毒H7型阴性，如果小于或等于35则为禽流感病毒H7型阳性。新城疫病毒阳性对照HEX通道的荧光信号必须有对数增长，有典型扩增曲线，Ct值应该小于或等于35。对待测样品，如果其HEX通道的Ct大于或等于40则为新城疫病毒阴性，如果小于或等于35则为新城疫病毒阳性。

关联产品
新型冠状病毒荧光及可视化LAMP检测试剂盒