CAT#:JW-15-16456
低温运输，-20℃保存

流脑A,B,Y群三重探针法荧光定量PCR试剂盒

产品及特点
脑膜炎奈瑟菌（Neisseria meningitidis，Nm）是世界范围内主要的流行病原菌之一，是导致流行性脑膜炎（简称流脑）的主要因素之一，严重时还能造成脑膜炎球菌败血症、血管炎及各种神经系统后遗症。人类是Nm唯一易感宿主，主要通过说话、打喷嚏等飞沫直接从空气传播，使Nm进入呼吸道而引起感染。Nm根据其荚膜多糖抗原表位的不同，分为A、B、C、D、29E、H、I、K、L、W135、X、Y和Z共13个血清群的菌群，其中A、B、C、W135、Y这5个血清群引起的疾病占全世界范围内流行菌群侵袭性发病率的90%以上。本产品就是以三重探针法荧光定量PCR技术为基础开发的专门检测脑膜炎A、B、Y群试剂盒，它具有下列特点：
1.即开即用，用户只需要提供样品DNA模板。
2.根据脑膜炎A/B/Y 保守区域设计引物，灵敏度均在100拷贝/反应左右。
3.提供阳性对照，便于区分假阴性样品。
4.快速，整个检测过程（按一个样品计）所需时间仅为 2.0 小时。
5.本产品足够50次20μL体系的探针法荧光定量PCR反应。
6.本产品只能用于科研。

规格及成分
成分                                                                              编号                       包装材料
2×Probe qPCR MagicMix                                           981201                500μL（本色盖）
荧光PCR专用模板稀释液                                            180701                1mL（绿色盖）
流脑A,B,Y群探针法qPCR引物-探针混合液                  15-16456ywpb    150μL（棕色管）
流脑A,B,Y群探针法qPCR阳性对照(1×10E7拷贝/μL)    pc16456              50μL（黄色盖）
使用手册                                                                      15-16456sc           1份

运输及保存
低温运输，-20℃保存，保存期限为12个月。

自备试剂
样品DNA。

使用方法
一、稀释PCR阳性对照（以10E1-10E6拷贝/μL这6个10倍稀释度为例）。由于标准品浓度非常高，因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行，千万不能污染样品或本试剂盒的其他成分）。为增加产品稳定性和避免扩散传染性病原本产品不提供活体样品做阳性对照，只提供无传染性的DNA片段作为阳性对照。本阳性对照由流感A、B和Y群专一性的三种DNA片段组成。
1.标记6个离心管，分别为6，5，4，3，2，1。
2.用带芯枪头分别加入45μL荧光PCR专用模板稀释液（最好用带芯枪头，下同）。
3.在6号管中加入5μL 1×10E7拷贝/μL的阳性对照（试剂盒提供），充分震荡1分钟，得1×10E6拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。
4.换枪头，在5号管中加入5μL 1×10E6拷贝/μL的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡1分钟，得1×10E5拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。换枪头，在5号管中加入5μL 1×10E6拷贝/μL的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡1分钟，得1×10E5拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。
5.换枪头，在4号管中加入5μL 1×10E5拷贝/μL的阳性对照（上步稀释所得)，充分震荡1分钟，得1×10E4拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。
6.重复上面的操作直到得到6个稀释度的标准曲线样品。放冰上用。

二、样品DNA的制备
7.如果有N个样品，必须设置N+2个提取，多出的一个是样品制备PC（样品制备阳性对照），一个是样品制备NC（样品制备阴性对照）。可以用10μL阳性对照的10000倍稀释液再加上一定量的水使总体积跟每次制备要求的体积一样，以此作为样品制备PC。另外用水作为样品制备NC。
8.用自选方法纯化样品的DNA，本试剂盒跟市场上大多数DNA提取试剂盒兼容。

三、Probe qPCR反应（20μL体系，在样品制备室进行）
9.如果做定量分析并且只做1次重复，则标记N+9个PCR管，其中N+2个用于上步得到的N+2个样品，1个用于PCR阴性对照（用水做模板），6个用于标准曲线。如果做定性分析，并且只做1次重复，则标记N+4个PCR管，其中N+2个用于上步得到的N+2个样品，1个用于PCR阴性对照（用水做模板），1个用于PCR阳性对照（用第4号管中的阳性对照稀释液做模板）。下面只以定量分析为描述操作步骤，
10.在标记管中按下表加入各成分（本表只列出一次重复。样品管和阴性对照设置完毕后才设置阳性对照，并且阳性对照样品要等所有管子盖上盖子储存好后最后加）：
成分                                                           样品管N+2个    PCR阴性对照管    标准曲线样品管（1-6）管）
2×Probe qPCR MagicMix                             10μL                   10μL                           各10μL
流脑A,B,Y群探针法qPCR引物-探针混合液    4μL                    4μL                             各4μL
待测样品DNA模板                                         6μL                    不加                            不加
超纯水                                                          不加                    7μL                              不加
第6步所得标准曲线样品稀释液（1-6号）    不加                    不加                   各6μL（1号样到1号管，2号样到2号管…）
11.盖上盖子后上机，按下面参数进行PCR：
过程                   温度    时间
预热                   50℃    2 min
预变性               95℃    10 min
qPCR反应
（45个循环）    95℃    15 sec
                          60℃    1min（采集FAM通道的荧光信号）
         （采集HEX通道的荧光信号）
         （采集ROX通道的荧光信号）
说明：FAM为A群专一性扩增，HEX为B群专一性扩增，ROX为Y群专一性扩增。

四、数据处理
12.如果把本试剂盒用于定量检测，则以阳性对照浓度的log值为横轴，以Ct值为纵轴，绘制标准曲线。再以待测样品的Ct值从标准曲线上推算出样品DNA浓度的log值，再推算出其浓度。一次实验可以得到三种靶分子的标准曲线，FAM通道得到的数据是A群的，HEX通道得到的数据是B的，ROX通道得到的数据是Y群。
13.如果把本试剂盒用于定性检测，只判断阳性或阴性，则阴性对照Ct必须大于或等于45。阳性对照必须有荧光对数增长，有典型扩增曲线，Ct值应该小于或等于40。对待测样品，如果其Ct大于或等于45则为阴性，如果小于或等于40则为阳性。如果在40-45之间，则重复一次。若重复结果Ct值小于45，扩增曲线有明显起峰，该样本判断为阳性，否则为阴性。一次实验可以得到三种靶分子的Ct，FAM通道得到的数据是A群的，HEX通道得到的数据是B的，ROX通道得到的数据是Y群。

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