CAT#:JW-15-15921-15907
低温运输，-20℃保存

甲型流感病毒H10N7亚型双重探针法qRT-PCR试剂盒

产品及特点
流感病毒分为甲、乙、丙三型，其中甲型流感病毒最容易发生变异，流感大流行就是甲型流感病毒出现新亚型或旧亚型重现引起的。甲型流感病毒是A型流感病毒，根据H和N抗原不同，又分为许多亚型，H可分为18个亚型(H10~H108)，N可分为11个亚型(N7~N71)。其中，H10N7最早于英国被发现，主要在水禽中流行，包括鸭、鹅和鹤等。近年来，H10N7也在人类中发现，但仍属于罕见病例。甲型流感病毒H10N7的传播途径与其他流感病毒相似，主要通过空气飞沫传播，也可以通过接触污染物体表面等途径传播，症状也与其他流感病毒相似，包括发热、咳嗽、喉咙痛、肌肉疼痛、头痛、乏力等。但由于该亚型在人类中的感染较少，临床表现尚未得到充分研究。因此快速检测甲型流感病毒H10N7亚型对水禽水产业具有重要意义。本产品就是以探针法qRT-PCR技术为基础开发的对甲型流感病毒H10亚型和N7亚型的分型检测的试剂盒，它具有下列特点：
1.即开即用，用户只需要提供样品RNA模板。
2.引物和探针经过优化，分析灵敏性高，可以达到100拷贝/反应。
3.提供阳性对照，便于排除假阴性结果。
4.特异性高，引物和探针分别根据甲型流感病毒H10亚型和N7亚型RNA高度保守区设计，不会跟其他生物的RNA发生交叉反应。
5.既可用于定性检测，又可用于定量检测。用于定量检测时线性范围至少为5个数量级。
6.两个探针分别用FAM和HEX标记，检测和分型同时完成。
7.本产品足够50次20 mL体系的探针法RT-PCR反应。
8.本产品只能用于科研。

规格及成分
本产品使用十孔盒包装
成分                                                                            编号                        规格           包装
探针法qRT-PCR缓冲液                                            990504a                    500 mL    0.5 mL本色管
探针法qRT-PCR酶混合液                                        990504b                    100 mL    0.5 mL红盖管
荧光PCR专用模板稀释液                                        180701                       1 mL        1.5 mL绿盖管
甲型流感病毒H10N7亚型RT-PCR引物-探针干粉     yp15-15921-15907     50次        0.5 mL棕色管
甲型流感病毒H10亚型阳性对照(1×10E7拷贝/mL)    pc15-15921                50 mL    0.5 mL黄盖管
甲型流感病毒N7亚型阳性对照(1×10E7拷贝/mL)     pc15-15907                 50 mL     0.5 mL白盖管
使用手册                                                                  15-15921-15907sc      1份               无
注意：引物-探针干粉在使用前需要短暂离心，然后在离心管中加入220 mL的超纯水充分混匀后再使用，未用完的需要-20℃保存。本试剂盒采用DNA作为阳性对照，不能有效监控核酸纯化和RT过程。如果需要RNA模板，需要另外定做。

运输及保存
低温运输，-20℃保存，保存期限为12个月。

自备试剂
样品RNA，超纯水

使用方法
一、稀释甲型流感病毒H10亚型检测标准曲线样品（以阳性对照10E1-10E6拷贝/mL这6个10倍稀释度）。由于标准品浓度非常高，因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行，千万不能污染样品或本试剂盒的其他成分。
1.标记6个离心管，分别为A6，A5，A4，A3，A2，A1。
2.在A1-A6号管中各加入45 mL荧光PCR专用模板稀释液。
3.在A6号管中加入5 mL 1×10E7拷贝/mL的阳性对照（试剂盒提供），充分震荡1分钟，得1×10E6拷贝/mL的标准曲线PC样品。放冰上待用。
4.换枪头，在A5号管中加入5 mL 1×10E6拷贝/mL的阳性对照（上步稀释所得），充分震荡1分钟，得1×10E5拷贝/mL的标准曲线样品。放冰上待用。
5.换枪头，在A4号管中加入5 mL 1×10E5拷贝/mL的阳性对照（上步稀释所得），充分震荡1分钟，得1×10E4拷贝/mL的标准曲线样品。放冰上待用。
6.重复上面的操作得到A1-A6共六个稀释度的标准曲线阳性样品。放冰上待用。

二、稀释甲型流感病毒N7亚型检测标准曲线样品
7.操作同上，只是使用甲型流感病毒N7亚型的PC作为模板。得到6个浓度的样本放冰上待用，分别是B1-B6。

三、样品RNA的制备
8.如果有N个样品，最好设置N+3个提取，多出的一个是甲型流感病毒H10亚型的PC（样品制备阳性对照），一个是甲型流感病毒N7亚型的PC（样品制备阳性对照），一个是NC（样品制备阴性对照）。可以用10 mL第一步和第二步所得的4号稀释液再加上一定量的水使总体积跟样本制备试剂盒所要求的起始样本体积一样，以此分别作为两个PC。另外用水作为NC，水的总体积需要跟样本制备试剂盒所要求的样本体积一样。注意：本试剂盒采用DNA作为阳性对照，不能有效监控核酸纯化和RT过程。如果需要RNA模板，需要另外定做。
9.用自选方法纯化样品的RNA。本试剂盒跟市场上大多数RNA提取试剂盒兼容，也可以选购本公司的免提取核酸释放剂。

三、Probe qRT-PCR反应（20 mL体系，在样品制备室进行）
10.如果做定量分析并且只做1次重复，则标记N+3+1+6+6个RT-PCR管，其中N+3个用于上步得到的N+3个样品，1个用于RT-PCR阴性对照（用水做模板），6个用于甲型流感病毒H10亚型的标准曲线，另外6个用于甲型流感病毒N7亚型的标准曲线。如果做定性分析并且只做1次重复，则标记N+3+3个RT-PCR管，其中N+3个用于上步得到的N+3个样品，1个用于RT-PCR阴性对照（用水做模板），1个用于甲型流感病毒H10亚型RT-PCR阳性对照，1个用于甲型流感病毒N7亚型RT-PCR阳性对照（直接用第一步和第二步所得的两个4号稀释液作为模板）。下面只以定量分析为例描述操作步骤。
11.在标记管中按下表加入各成分（本表只列出一次重复）：
成分                                                            样品管N+3个    RT-PCR阴性对照    标曲样品管（A1-A6）    标曲样品管（B1-B6）
探针法qRT-PCR缓冲液                                            各10 mL      10 mL                各10 mL                   各10 mL
探针法qRT-PCR酶混合液                                         各2 mL        2 mL                  各2 mL                    各2 mL
甲型流感病毒H10N7亚型RT-PCR引物-探针混合液  各4 mL        4 mL                  各4 mL                    各4 mL
N+3个待测RNA                                                        各4 mL       不加                    不加                         不加
超纯水                                                                       不加            4 mL                  不加                           不加
第一步所得标准曲线样品稀释液（A1-A6号）          不加            不加            各4 mL（A2号样到A2号管，A3号样到A3号管…）    不加
第二步所得标准曲线样品稀释液（B1-B6号）           不加            不加            不加    各4 mL（B2号样到B2号管，B3号样到B3号管…）
12.盖上盖子后上机，按下面参数进行RT-PCR：
过程                   温度    时间
逆转录                50℃    15 min
预变性                95℃    10 min
RT-PCR反应
（45个循环）    94℃    30 sec
                         60℃    60 sec（采集FAM通道和HEX通道两个通道的荧光信号，
淬灭基团均为TAMRA）

四、数据处理
13.如果扩增阳性对照或制备阳性对照结果为阴性，则整个扩增或制备实验无效，不需要分析数据，需要重做扩增或制备或跟厂家联系。如果扩增阴性对照或制备阴性对照结果为阳性，说明环境污染，则整个扩增或制备实验无效，不需要分析数据，需要跟厂家联系，购买新的引物和探针。
14.如果阴性对照和阳性对照正常，则实验有效，可以进入后续分析。
15.对定量检测，以标曲样本浓度的log值为横轴，分别以甲型流感病毒H10亚型阳性对照（FAM通道）和甲型流感病毒N7亚型阳性对照（HEX通道）的Ct值为纵轴，绘制两条标准曲线，r2必须大于0.95。再以待测样品的Ct值从分别从两条标准曲线上推算出对应样品RNA浓度的log值，再推算出其浓度。
16.对定性检测，只判断阳性或阴性，则阴性对照FAM通道的Ct必须大于或等于40。阳性对照FAM通道的荧光信号必须有对数增长，有典型扩增曲线，Ct值应该小于或等于35。对待测样品，如果其FAM通道的Ct大于或等于40则为甲型流感病毒H10亚型阴性，如果小于或等于35则为甲型流感病毒H10亚型阳性。如果其HEX通道的Ct大于或等于40则为甲型流感病毒N7亚型阴性，如果小于或等于35则为甲型流感病毒N7亚型阳性。如果在35-40之间，则重复一次。重复实验的Ct值如果大于或等于40则为阴性，如果小于40，则为阳性。

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