CAT#:JW-15-15899
低温运输，-20℃保存

甲型流感病毒/乙型流感病毒/新型冠状病毒三重探针法qRT-PCR试剂盒

产品及特点
呼吸道感染常见的病原体主要包括病毒、支原体、细菌三大类，其中由病毒感染引发的呼吸道感染疾病占总数的85%以上。流行性较强的流感病毒包括甲型流感病毒和乙型流感病毒，这两种病毒的临床症状与新冠病毒感染的临床症状相似增加了防控压力。甲型流感病毒、乙型流感病毒及新型冠状病毒的流行给人类健康造成不良影响，因此快速检测和区分甲型流感病毒、乙型流感病毒及新型冠状病毒具有重要的意义本产品就是以探针法qRT-PCR技术为基础开发的同时检测甲流、乙流及新冠的检测试剂盒，它具有下列特点：
1.即开即用，用户只需要提供样品RNA模板。
2.引物和探针经过优化，分析灵敏性高，可以达到100拷贝/反应。
3.提供阳性对照，便于排除假阴性结果。
4.特异性高，引物和探针分别根据甲流病毒RNA、乙流病毒RNA及新冠病毒RNA高度保守区设计，不会跟其他生物的RNA发生交叉反应。
5.既可用于定性检测，又可用于定量检测。用于定量检测时线性范围至少为4
个数量级。
6.甲流病毒、乙流病毒及新冠病毒的三个基因分别用FAM、ROX和HEX标记的三个探针检测。
7.本产品足够50次20μL体系的探针法RT-PCR反应。
8.本产品只能用于科研。

规格及成分
本产品使用十孔盒包装
成分                                                                               编号           规格       包装
探针法RT-PCR缓冲液                                               990504a        500 μL    0.5 mL蓝盖管
探针法RT-PCR酶混合液v2                                        990504bv2    100 μL    0.5 mL红盖管
荧光PCR专用模板稀释液                                           180701          1 mL      1.5 mL绿盖管
甲流、乙流及新冠病毒三重RT-PCR引物-探针干粉    Yp15-15899    50次    0.5 mL棕色管
甲型流感病毒阳性对照（1×10E7拷贝/μL）                Pc15900        50 μL    0.5 mL棕色管
乙型流感病毒阳性对照（1×10E7拷贝/μL）                Pc37600        50 μL    0.5 mL棕色管
新型冠状病毒阳性对照（1×10E7拷贝/μL）                Pc81940        50 μL    0.5 mL黄盖管
使用手册                                                                     15-15899sc    1份            无
注意：在使用前需要短暂离心引物-探针干粉管，然后在离心管中加入220uL的超纯水充分混匀后再使用，未用完的需要-20℃保存

运输及保存
低温运输，-20℃保存，保存期限为12个月。

自备试剂
样品RNA。

使用方法
一、稀释甲型流感病毒标准曲线样品（以10E1-10E6拷贝/μL这6个10倍稀释度为例）由于标准品浓度非常高，因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行，千万不能污染样品或本试剂盒的其他成分）。为增加产品稳定性和避免扩散传染性病原，本产品不提供活体样品做阳性对照，只提供无传染性的DNA片段作为阳性对照。
1.1.标记6个离心管，分别为A6，A5，A4，A3，A2，A1。
2.用带芯枪头分别加入45μL荧光PCR专用模板稀释液，最好用带芯枪头，
下同）。
3.在6号管中加入5μL1×10E7拷贝/μL的阳性对照(试剂盒提供)，充分震荡1分钟，得1×10E6拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。
4.换枪头，在5号管中加入5μL1×10E6拷贝/μL的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡1分钟，得1×10E5拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。
5.换枪头，在4号管中加入5μL1×10E5拷贝/μL的阳性对照(上步所得)，充分震荡1分钟，得1×10E4拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。
6.重复上面的操作得到A1-A6共六个稀释度标准曲线阳性样品。放冰上待用。

二、稀释乙型流感病毒检测标准曲线样品
7.操作同上，只是使用试剂盒提供乙型流感病毒阳性对照作为模板。得到6个浓度的样本放冰上待用，分别是B1-B6。

三、稀释新型冠状病毒检测标准曲线样品
8.操作同上，只是使用试剂盒新型冠状病毒阳性对照作为模板。得到6个浓度的样本放冰上待用，分别是C1-C6。

四、样品RNA的制备
9.如果有N个样品，最好设置N+2个提取，多出的一个是新型冠状病毒的PC（样品制备阳性对照），一个是NC（样品制备阴性对照）。可以用自备的、确定是阳性的样本作为样品制备阳性对照，可以用自备的、确定是阴性的样本作为样品制备阴性对照，可以用水替代。
10.用自选方法纯化样品的RNA（含内参），本试剂盒跟市场上大多数RNA提取试剂盒兼容。

五、Probe RT-PCR反应（20μL体系，在样品制备室进行）
11.如果有N+2个核酸提取，则设置N+3个RT-PCR反应，多出的一个是扩增阴性对照。再根据需要做1-3个标曲，每个标曲需要6个反应。下表只是以做1个N基因的标曲为例。如果还要做S和E基因的标曲，请参考下表再各设置6各标曲反应：
成分                                                                       样品管N+2个    RT-PCR阴性对照    标曲样品管（A1-A6）
探针法qRT-PCR缓冲液                                                各10 μL               10 μL                      各10 μL
探针法qRT-PCR酶混合液 v2                                        各2 μL                 2 μL                        各2 μL
甲流、乙流及新冠病毒三重RT-PCR引物-探针混合液    各4 μL                4 μL                        各4 μL
N+2个待测RNA                                                              各4 μL               不加                        不加
超纯水                                                                             不加                  4 μL                        不加
第一步所得标准曲线样品稀释液（A1-A6号）                不加                    不加           各4μL（A1号样到A1号管，A2号样到A2号管…）
12.盖上盖子后上机，按下面参数进行RT-PCR：
过程                   温度    时间
逆转录               50℃    15 min
预变性                95℃    10 min
PCR反应
（45个循环）    94℃    30 sec
                          60℃    60 sec（采集FAM通道、ROX通道和HEX通道的荧光信号，淬灭基团均为TAMRA）
六、数据处理
13.如果所有标曲扩增或制备阳性对照结果为阴性，则整个扩增或制备实验无效，不需要分析数据，需要重做扩增或制备或跟厂家联系。如果扩增阴性对照或制备阴性对照结果为阳性，说明环境污染，则整个扩增或制备实验无效，不需要分析数据，需要跟厂家联系，购买新的引物和探针。
14.如果阴性对照和阳性对照正常，则实验有效，可以进入后续分析。
15.如果把本试剂盒用于定量检测，则以阳性对照浓度的log值为横轴，分别以甲型流感病毒、乙型流感病毒及新型冠状病毒的阳性对照（FAM通道、HEX通道和ROX通道）Ct值为纵轴，绘制标准曲线，阳性对照的标准曲线为斜线，r2必须大于0.95。再以待测样品的Ct值从阳性对照的标准曲线上推算出样品RNA浓度的log值，再推算出其浓度。
16.对定性检测，只判断阳性或阴性，则阴性对照FAM通道、HEX通道和ROX通道的Ct必须大于或等于40。甲型流感病毒、乙型流感病毒及新型冠状病毒阳性对照FAM通道、ROX通道和HEX通道的荧光信号必须有对数增长，有典型扩增曲线，Ct值应该小于或等于35。对待测样品，如果其FAM通道的ct值大于或等于40则为甲型流感病毒阴性，如果小于或等于35则为甲型流感病毒阳性。如果其ROX通道的ct值大于或等于40则为乙型流感病毒阴性，如果小于或等于35则为乙型流感病毒阳性。如果其HEX通道的ct值大于或等于40则为新型冠状病毒阴性，如果小于或等于35则为新型冠状病毒阳性。

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