CAT#:JW-15-116
低温运输，-20℃保存

马源性成分探针法qPCR试剂盒（不含内参）

产品及特点
本试剂盒可用于检测食品或其他材料中是否有马源性成分。现代食品加工工艺极大改变了食材原有的味道、气味、色泽、纹理和质地等特性，因此传统的感官鉴别技术已经无法对食材的真伪进行准确的鉴定。同时部分食材还有致敏性，因此基于基因检测的快速灵敏的食材来源检测技术将对食品监管和安全提供重要的保障。本公司开发了简单快捷的马源性成分探针法荧光定量PCR检测试剂盒，它具有下列特点：
1.即开即用，用户只需要提供样品DNA模板。
2.提供阳性对照，便于区分假阴性样品。
3.根据马保守区域设计引物和探针，能专一性地检测出样品中的马成分，但不能检测其他非榛子成分。
4.对混合样品中马成分的检测下限为0.01%，对样品中马成分的核酸检测下限为0.1ng/µL。
5.既可以定性检测，也可以定量检测。用于定量时线性范围至少有5个数量级。
6.提供阳性对照，便于区分假阴性样品。
7.一管式闭管操作，降低了交叉污染。
8.快速，整个检测过程（按一个样品计）所需时间仅为2.0小时。
9.本只能用于科研，足够50次20μL体系的荧光定量PCR。
10.本产品只可用于科研。

规格及成分
本产品采用五孔盒包装
成分                                                                    编号             规格       包装
2×Probe qPCR MasterMix                                981201          0.5 mL    0.5mL本色盖
荧光PCR专用模板稀释液                                180701           1 mL      1.5mL绿盖管
超纯水                                                              210806            1 mL    1.5mL蓝盖管
马源性成分qPCR引物-探针干粉                       yp15-116         50次    1.5mL棕色管
马源性成分qPCR阳性对照(1×10E7拷贝/μL)    pc60908-873    50 μL    0.5mL黄盖管
使用手册                                                           15-116sc           1份            无
注意：引物-探针干粉在使用前需要短暂离心，然后在离心管中加入162uL的超纯水充分混匀后再使用，未用完的需要-20℃保存。

运输及保存
低温运输，-20℃保存，保存期限为24个月。

自备物品
样品DNA。

使用方法
一、稀释标准曲线样品（以10E1-10E6拷贝/μL这6个10倍稀释度为例）。由于标准品浓度非常高，因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行，千万不能污染样品或本试剂盒的其他成分）。为增加产品稳定性和避免扩散传染性病原，本产品不提供活体样品做阳性对照，只提供无传染性的DNA片段作为阳性对照。
1.标记6个离心管，分别为6，5，4，3，2，1。
2.用带芯枪头分别加入45 μL荧光PCR专用模板稀释液，最好用带芯枪头，下同）。
3.在6号管中加入5 μL 1×10E7拷贝/μL 的阳性对照(试剂盒提供)，充分震荡1分钟，得1×10E6拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。
4.换枪头，在5号管中加入5 μL 1×10E6拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡1分钟，得1×10E5拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。
5.换枪头，在4号管中加入5 μL 1×10E5拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡1分钟，得1×10E4拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。
6.重复上面的操作直到得到6个稀释度的标准曲线样品。放冰上待用。

二、样品DNA的制备
7.如果有N个样品，最好设置N+2个提取，多出的一个是PC（样品制备阳性对照），一个是NC（样品制备阴性对照）。可以用10μL上步所得4号稀释液再加上一定量的水使总体积跟核酸制备试剂盒所要求的起始样本体积一样，以此作为PC。另外用水作为NC。
8.用自选方法纯化样品的DNA，本试剂盒跟市场上大多数样品DNA提取试剂盒兼容。也可以选购本公司的免提取核酸释放剂。

三、Probe qPCR反应（20μL体系，在样品制备室进行）
9.如果做定量分析并且只做1次重复，则标记N+9个PCR管，其中N+2个用于上步得到的N+2个样品，1个用于PCR阴性对照（用水做模板），6个用于标准曲线。如果做定性分析并且只做1次重复，则标记N+4个PCR管，其中N+2个用于上步得到的N+2个样品，1个用于PCR阴性对照（用水做模板），1个用于PCR阳性对照（直接用第6步第4号管的阳性对照稀释液做模板）。下面只以定量分析为例描述操作步骤。
10.在标记管中按下表加入各成分（本表只列出一次重复。样品管和阴性对照设置完毕后才设置阳性对照，并且阳性对照样品要等所有管子盖上盖子储存好后最后加）：

成分                                                        样品管N+2个    PCR阴性对照    标准曲线样品管(1-6管）
2×Probe qPCR MasterMix                       各10 μL           10 μL                     各10 μL
马源性成分qPCR引物-探针混合液            各3 μL            3 μL                        各3 μL
 N+2个待测DNA样本                                 各7 μL            不加                       不加
超纯水                                                        不加                7 μL                     不加
第6步所得标准曲线样品稀释液（1-6号）    不加               不加               各7μL（2号样到2号管，3号样到3号管…）
11.盖上盖子后上机，按下面参数进行PCR：
过程                   温度    时间
预变性                95℃    5min
PCR反应
（45个循环）    95℃    15 sec
                        60℃    60 sec（采集FAM通道的荧光信号，设置BHQ为淬灭基团）

四、数据处理
12.如果扩增阳性对照或制备阳性对照结果为阴性，则整个扩增或制备实验无效，不需要分析数据，需要重做扩增或制备或跟厂家联系。如果扩增阴性对照或制备阴性对照结果为阳性，说明环境污染，则整个扩增或制备实验无效，不需要分析数据，需要跟厂家联系，购买新的引物和探针。
13.如果阴性对照和阳性对照正常，则实验有效，可以进入后续分析。
14.如果把本试剂盒用于定量检测，则以阳性对照浓度的log值为横轴，以Ct值为纵轴，绘制标准曲线。再以待测样品的Ct值从标准曲线上推算出样品DNA浓度的log值，再推算出其浓度。
15.如果把本试剂盒用于定性检测，只判断阳性或阴性，则阴性对照必须无Ct或Ct大于或等于40。阳性对照必须有荧光对数增长，有典型扩增曲线，Ct值应该小于40，否则实验无效。如果实验有效，则分析待测样品，如果无Ct或Ct大于或等于40，则为阴性。如果Ct小于40则为阳性。

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