CAT#:JW-15-00003
低温运输,-20℃保存

人端粒酶活性检测试剂盒（探针法TRAP）

产品及特点
端粒酶存在于85-90%的肿瘤组织中，因此通过检测端粒酶活性就有可能早期诊断大多数肿瘤。目前最常用的检测端粒酶活性的方法就是TRAP (Telomeric Repeat Amplification Protocol，端粒重复片段扩增)，它利用端粒酶能在底物DNA末端添加不同数量的TTAGGG序列这一特点，通过PCR检测延伸产物而高效检测端粒酶活性。但是传统的TRAP方法为终点电泳检测法，灵敏度低，没法定量，同时还容易产生气溶胶污染。为克服这些缺点，本公司开发了基于探针法qPCR的TRAP试剂盒。它具有以下特征：
1.即开即用，提供从细胞裂解到qPCR所有试剂，免去自己优化条件。
2.基于探针法荧光定量PCR，比电泳法TRAP灵敏度高。
3.使用探针，专一性比电泳法TRAP高。
4.提供阳性对照，可以进行基于此对照的定量分析。
5.一管式操作，免去气溶胶污染之忧。
6.既可用于定量，又可用于定性。用于定量时线性范围至少有5个数量级。
7.既可用于培养细胞，也可用于实体组织（包括肿瘤组织）。
8.本产品足够50次20uL体系的TRAP PCR检测。
9.本产品只能用于科研。

规格及成分
本产品采用小扁盒包装
编号                                                       编号                           规格      包装
TRAP专用细胞裂解液                            15-00003a                10 mL    10mL本色瓶
2×TRAP专用qPCR MasterMix                15-00003b                0.5mL    0.5mL本色盖
荧光PCR模板专用稀释液                        180701                    1.0mL    1.5mL绿色盖
人TRAP检测阳性对照（10E7拷贝/μL）    pc15-00003            50 μL    0.5mL黄色盖
人端粒酶底物干粉                                    yw15-00003dx-TS    50 次    0.5mL白色盖
人TRAP引物-探针干粉                             yp15-00003dx            50 次    1.5mL棕色管
超纯水                                                      210806                      1 mL    1.5mL蓝色盖
使用手册                                                  15-00003sc                   1份            无
注意：首次使用本产品时需要在人端粒酶底物干粉中加入55μL的超纯水；人TRAP引物-探针干粉管中加入165μL的超纯水。分别涡旋震荡1分钟溶解，短暂离心后放冰上待用。每次没有用完的需要放-20℃保存。

运输及保存
低温运输，-20℃保存，有效期24个月。

自备试剂
BCA蛋白浓度测定试剂盒，固相RNase清除剂

使用方法
一：标准曲线样品的制备
以阳性对照10E1-10E6拷贝/μL这6个10倍稀释度为例。由于标准品浓度非常高，因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行，不能污染样品或本试剂盒的其他成分。
1.标记6个离心管，分别为6，5，4，3，2，1。
2.在1-6号管中加入45μL荧光PCR专用模板稀释液。
3.在6号管中加入5 μL 1×10E7拷贝/μL 的人TRAP检测阳性对照(试剂盒提供)，充分震荡1分钟，得1×10E6拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。
4.换枪头，在5号管中加入5 μL 1×10E6拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡1分钟，得1×10E5拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。
5.换枪头，在4号管中加入5 μL 1×10E5拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡1分钟，得1×10E4拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。
6.重复上面的操作直到得到6个稀释度的标准曲线阳性样品。放冰上待用。

二：端粒酶的提取
注意：端粒酶的组成成分中有RNA，极容易被降解，因此，提取端粒酶应该跟提取RNA一样，尽量在低温条件下快速操作、最好使用本公司的固相RNase清除剂预先清洁试验台面等容易有RNase污染的地方。
7.对冷冻的实体组织：将50-100mg在-80℃冷冻的组织放装有液氮的研钵中研磨成粉末，再转移到预冷的玻璃匀浆器中，加入200μL 预冷的TRAP专用细胞裂解液，温和手动匀浆6次后冰浴30分钟，每间隔5分钟涡旋振荡一次，然后直接进入第10步操作。
注意：为保证裂解效果，可在显微镜下观察确保大部分细胞已经裂解。如果组织样品不足50-100mg，可以按比例降低TRAP专用细胞裂解液用量。在-20℃保存的实体组织放置2个月后就失去端粒酶活性，而在-80℃保存的实体组织放置数年还有端粒酶活性。
8.对新鲜的培养细胞和组织：用自备的预冷PBS洗涤10E6个经过胰酶处理的细胞或50-100mg经过胰酶处理的新鲜组织，3000g 4℃离心5分钟，弃上清，细胞沉淀可以直接使用，也可以放-80℃保存后续使用。在细胞或组织沉淀中加入200μL预冷的TRAP专用细胞裂解液，轻柔吹打3次悬浮细胞或组织。对新鲜细胞：涡旋振荡10秒后置冰浴30分钟，每间隔5分钟涡旋振荡一次。对新鲜组织：在冰上用玻璃匀浆器轻柔匀浆后冰浴30分钟，每间隔5分钟涡旋振荡一次。如果细胞不足1×10E6或50-100mg，按比例降低TRAP专用细胞裂解液用量。
9.14000g 4℃离心20分钟，收集160μL上清（含端粒酶），留40μL不取。
10.取部分上清液用自备BCA蛋白浓度测定试剂盒测定总蛋白浓度。
11.测出各样品的蛋白浓度后，用TRAP专用细胞裂解液将各样品的蛋白浓度调成3μg/μL，然后分装合适的量到离心管中，将实验所需的数量放冰上待用，其余的放-80℃长期保存（可存放一年）。此步所得样本称为端粒酶待测样本。
12.对每个样本，一次实验需要两管，一管用于测定端粒酶活性，一管用作该待测样本的热灭活阴性对照。制备方式是每个样本取一管端粒酶待测样本，95℃处理10分钟灭活端粒酶，放冰上待用。没有用完的可放-80℃长期保存（可存放一年）供下次使用。

二：探针法TRAP（20uL体系）
13.确定端粒酶待测样本的：为便于比较，每个反应所用的蛋白量总量（或对应的细胞数）必须一样，否则不好进行样本间的比较。
14.设置反应。如果有N个样品，每个样品做1次重复（一般建议作三个重复，此处为表述方便，假设只做1次重复），则需要准备2N+6个反应管。多1倍是因为每个样本都需要一个对应的热灭活阴性对照。另外1个用作探针法TRAP阴性对照，最后5个用于标准曲线样本。按下表设置20μL体系的探针法TRAP：
成份                            N个样品管    N个热灭活阴性对照管    探针法TRAP阴性对照    标准曲线样品管（1-6管）
人端粒酶底物溶液            各1μL                   各1μL                            1μL                           1μL
第11步所得
N个端粒酶待测样本           各1μL                    -                                    -                                   -
第12步所得
N个热灭活阴性对照样本    -                          各1μL                            -                                           -
TRAP专用细胞裂解液            -                        -                                    1μL                                    -
第6步所得标准曲线样品稀释液（1-6号）                各1μL（2号样到2号管，3号样到3管…）
人TRAP引物-探针混合液    各3μL                    各3μL                          3μL                           3μL
2×TRAP专用qPCR MasterMix    各10μL    各10μL                            10μL                            10μL
超纯水                            各5μL                   各5μL                               5μL                            5μL
15.吹打混匀后上机进行端粒延伸和PCR扩增，反应参数如下：
过程                  温度    时间
端粒延伸           30℃    30min
预变性                95℃    5min
PCR反应
（40个循环）    95℃    15 sec
                        57.5℃    15 sec
                        72℃    30 sec（采集FAM通道，淬灭基团为MGB）
三：结果分析
16.实验的有效性判断：如果标准曲线样本管的FAM信号结果为阴性（无Ct值，或者大于或等于35），则整个实验无效，不需要分析数据，需要重复实验或跟厂家联系。如果探针法TRAP阴性对照管的FAM信号结果均为阳性（有Ct值小于35），说明环境污染，则整个实验无效，不需要分析数据，需要跟厂家联系。如果标准曲线样本管的FAM信号结果为阳性，探针法TRAP阴性对照管的结果为阴性，则实验有效，可以进入下步分析。
17.标准曲线制作：以5个标准曲线样本浓度的log值为横轴，以阳性对照（FAM通道）的Ct值为纵轴，绘制标准曲线，阳性对照的标准曲线为斜线，r2必须大于0.95。再以待测端粒样品的Ct值从阳性对照的标准曲线上推算出待测端粒酶所合成的端粒重复序列的拷贝数的log值，再有此log值推算出新合成的端粒重复序列拷贝数。由于新合成的端粒DNA重复序列的拷贝数跟端粒酶的活性相关。因此端粒酶活性大小跟测试的Ct呈现反相关，同一次实验所得的Ct值可以用来比较各所测各样本中端粒活性的相对大小。

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