CAT#:JW-14-45200
低温运输，-20℃保存

辛德毕斯病毒染料法RT-PCR试剂盒

产品及特点
辛德毕斯病毒（Sindbis Virus，SINV）为单股正链RNA病毒，基因组全长约11kb，能够感染人和多种动物。感染辛德毕斯病毒病主要临床症状包括关节疼痛和疲倦乏力，可持续数周至数月，也可引起全身性反应，主要表现为轻度发热、眼周痛、头痛、恶心呕吐、倦怠乏力、手部有麻刺感，关节痛和多发性关节炎，腹股沟、枕部和颈部淋巴节肿大等。重症病例出现脑炎等中枢神经系统症状。辛德毕斯病毒感染影响人和多种动物健康，因此快速检测辛德毕斯病毒具有重要意义。荧光定量PCR是检测传染性疾病的主流技术，本产品就是以染料法荧光定量PCR技术为基础开发的专门检测辛德毕斯病毒的试剂盒，它具有下列特点：
1.即开即用，用户只需要提供样品DNA模板。
2.引物经过优化，灵敏性高，分析灵敏度可以达到100拷贝/反应。
3.提供阳性对照，便于区分假阴性样品。
4.特异性高，引物是根据辛德毕斯病毒高度保守区设计，不会跟其他生物的DNA发生交叉反应。
5.本产品足够50次20μL体系的染料法荧光定量PCR反应。
6.既可用于定性，也可用于定量。用于定量时线性范围至少5个数量级。
7.本产品只能用于科研。

规格及成分
本产品采用五孔盒包装
成分                                                                                    编号                规格           包装
2×SYBR qRT-PCR 缓冲液                                                 990102a          500 mL    0.5 mL本色管
10×SYBR qRT-PCR酶混合液v2                                         990102bv2      50 mL     0.5 mL红盖管
荧光PCR模板专用稀释液                                                    180701          1 mL         1.5 mL绿盖管
辛德毕斯病毒染料法RT-PCR引物干粉                                yw14-45200    50次        0.5 mL白盖管
辛德毕斯病毒染料法RT-PCR阳性对照(1×10E7拷贝/mL)    pc45200          50 mL     0.5 mL黄盖管
使用手册                                                                            14-45200sc       1份            无
注意：引物干粉在使用前需要短暂离心，然后在离心管中加入110 mL的超纯水充分混匀后再使用，未用完的需要-20℃保存。

运输及保存
低温运输，-20℃保存，保存期限为12个月。阳性对照需要单独放置。

自备物品
超纯水，样品RNA。

使用方法
一、稀释阳性对照（以10E1-10E6这6个10倍稀释度为例。由于标准品浓度非常高，因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行）。
1.标记6个离心管，分别为6，5，4，3，2，1。用带芯枪头分别加入45 mL 荧光PCR专用模板稀释液，最好用带芯枪头，下同）。
2.换枪头，在6号管中加入5 mL 1×10E7拷贝/mL的阳性对照(试剂盒提供)，充分震荡1分钟，得1×10E6拷贝/mL的阳性对照。放冰上待用。
3.换枪头，在5号管中加入5 mL 1×10E6拷贝/mL的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡1分钟，得1×10E5拷贝/mL的阳性对照。放冰上待用。
4.换枪头，在4号管中加入5 mL 1×10E5拷贝/mL的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡1分钟，得1×10E4拷贝/mL的阳性对照。放冰上待用。
5.重复上面的操作直到得到6个稀释度的阳性对照。放冰上待用。

二、样品RNA的制备
6.如果有N个样品，必须设置N+2个提取，多出的一个是PC（样品制备阳性对照），一个是NC（样品制备阴性对照）。可以用10 mL上得到的阳性对照梯度稀释液中的第4号（浓度为1×10E4拷贝/mL，10 mL相当于1万拷贝）再加上一定量的水作为制备的阳性对照（加水后其总体积跟样品一样，样品体积多少取决于所用试剂盒的要求）。可以用水作为制备的阴性对照。
7.用自选方法纯化N+2个样品的RNA，本试剂盒跟市场上大多数病毒样品RNA提取试剂盒兼容，也可以选购本公司的免提取核酸释放剂。

三、设置RT-PCR反应（20 mL体系，在样品制备室进行）
8.如果做定量分析并且只做1次重复，则标记N+9个PCR管，其中N+2个用于上步得到的N+2个样品，1个用于PCR阴性对照（用水做模板），6个用于标准曲线。如果做定性分析，并且只做1次重复，则标记N+4个PCR管，其中N+2个用于上步得到的N+2个样品，1个用于PCR阴性对照（用水做模板），1个用于PCR阳性对照（用第4号管的阳性对照稀释液做模板）。下面只以定量分析为例描述操作步骤。
9.在标记管中按下表加入各成分（本表只列出一次重复。样品管和阴性对照设置完毕后才设置阳性对照，阳性对照样品要等所有管子盖上盖子后最后加）：
成分                                                N+2个制备所得样品    RT-PCR阴性对照    RT-PCR阳性对照（1-6管）
2×qRT-PCR缓冲液                                   10 mL                   10 mL                         各10 mL
10×SYBR qRT-PCR酶混合液v2                1 mL                   1 mL                           1 mL
辛德毕斯病毒染料法RT-PCR引物混合液    2 mL                  2 mL                           各2 mL
N+2个RNA模板                                          7 mL                   不加                           不加
自备超纯水                                                不加                    7 mL                           不加
6个阳性对照稀释液                                   不加                    不加               各7 mL（1号样到1号管，2号样到2号管…）
10.上机后按下面参数进行RT-PCR。
过程                    温度    时间
RT（逆转录）    50℃    30 min
预变性                95℃    10min
PCR反应
（35个循环）    95℃    15 sec
                           60℃    60 sec（采集SYBR通道的荧光信号）
按仪器预设程序进行溶解曲线分析
注意：循环次数最好不要超过35次。

四、数据处理
11.通过溶解曲线分析的结果排除无效数据。有Ct值，但Tm值跟阳性对照Tm不一样的样品（包括对照和待测样品），归为假阳性，数据无效，不予以分析。Tm跟阳性对照Tm一致的，为有效Ct。
12.如果两种阴性对照的溶解曲线所得Tm值跟阳性对照的Tm值一样，说明环境或试剂可能有过去的qRT-PCR扩增产物污染，则此次实验无效，需要解决污染问题再进行实验。
13.如果两种阴性对照（样品制备阴性对照和qRT-PCR阴性对照）是假阳性，可以继续分析其它样品有效数据。
14.对定量检测，以阳性对照样品的浓度的log值为横轴，以有效Ct值为纵轴，绘制标准曲线。再以待测样品的有效Ct值从标准曲线上推算出样品RNA浓度的log值，再换算出待测样品的RNA浓度。
15.对定性检测，则有有效Ct值的为阳性，无有效Ct值的为阴性。

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