CAT#:JW-14-15909
低温运输，-20℃保存

甲型流感病毒N9亚型染料法RT-PCR试剂盒

产品及特点
流感病毒（Influenza Virus，IV）分为甲、乙、丙三型，甲型流感病毒是A型流感病毒，基因组包含8个负链RNA片段。甲型流感病毒依据其血凝素和神经氨酸酶抗原性的不同分为各种亚型，根据血凝素可分为18个亚型(H1~H18)，根据神经氨酸酶可分为11个亚型(N1~N11)。N9亚型主要在禽类中传播，N9亚型是低致病性的，但它可以与其他病毒或细菌共同引起感染，形成新的重组病毒。近年来有研究表明该分型也可感染人类，该病毒可通过人与人之间接触传播，对人类身体健康产生影响，因此快速检测甲型流感病毒N9亚型具有重要意义。为此本公司以染料法qRT-PCR技术为基础开发了甲型流感病毒N9亚型的检测试剂盒，它具有下列特点：
1.一站式，不需要单独准备每种成分，只需要提供RNA样品。
2.基于染料法qRT-PCR检测，灵敏度比常规RT-PCR高10-100倍，可以达到至少100拷贝/反应。
3.根据甲型流感病毒N9亚型的保守基因序列设计的引物，具有良好的特异性，不会跟其它生物的RNA发生交叉反应。
4.使用一管式qRT-PCR技术，RT和PCR两步在一个试管内完成，不需要中间转移样品，降低了操作误差和可能的污染。
5.本产品既可用于定性检测，也可用于定量检测。用于定量检测时线性范围至少有5个数量级。
6.本产品足够50次20 μL体系的RT-PCR反应
7.只能用于科研，不能用于临床。

规格及成分
本产品采用五孔盒包装
成分                                                                                   编号                           规格           包装
2×SYBR qRT-PCR 缓冲液                                                990102a                    500 μL    0.5 mL本色管
10×SYBR qRT-PCR酶混合液v2                                        990102bv2                 50 μL     0.5 mL红盖管
荧光PCR模板专用稀释液                                                  180701                        1 mL     1.5 mL绿盖管
甲型流感病毒N9亚型RT-PCR引物干粉                             yw15-15909yl              50次      0.5 mL白盖管
甲型流感病毒N9亚型RT-PCR阳性对照（1E7拷贝/μL）    pc15909-KC853231    50 μL    0.5 mL黄盖管
使用手册                                                                            14-15909sc                   1份            1份
注意：引物干粉在使用前需要短暂离心，然后在离心管中加入110 μL的超纯水充分混匀后再使用，未用完的需要-20℃保存。

运输及保存
低温运输，-20℃保存，保存期限为24个月。阳性对照需要单独放置。

自备试剂
超纯水，样品RNA

使用方法
一、稀释阳性对照（以1E1-1E6这6个10倍稀释度为例。由于标准品浓度非常高，因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行）。
1.标记6个离心管，分别为6、5、4、3、2、1。用带芯枪头分别加入45 μL 荧光PCR专用模板稀释液，最好用带芯枪头，下同。
2.换枪头，在6号管中加入5 μL 1E7拷贝/μL 的阳性对照(试剂盒提供)，充分震荡1分钟，得1E6拷贝/μL的阳性对照。放冰上待用。
3.换枪头，在5号管中加入5 μL 1E6拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡1分钟，得1E5拷贝/μL的阳性对照。放冰上待用。
4.换枪头，在4号管中加入5 μL 1E5拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡1分钟，得1E4拷贝/μL的阳性对照。放冰上待用。
5.重复上面的操作直到得到6个稀释度的阳性对照。放冰上待用。

二、样品RNA的制备
6.如果有N个样品，必须设置N+2个提取，多出的一个是PC（样品制备阳性对照），一个是NC（样品制备阴性对照）。可以用10 μL上得到的阳性对照梯度稀释液中的第4号（浓度为1E4拷贝/μL，10 μL相当于1万拷贝）再加上一定量的水作为制备的阳性对照（加水后其总体积跟样品一样，样品体积多少取决于所用试剂盒的要求）。可以用水作为制备的阴性对照。
7.用自选方法纯化N+2个样品的RNA，本试剂盒跟市场上大多数病毒样品RNA提取试剂盒兼容，也可以选购本公司的免提取核酸释放剂。

三、设置RT-PCR反应（20 μL体系，在样品制备室进行）
8.如果做定量分析并且只做1次重复，则标记N+9个PCR管，其中N+2个用于上步得到的N+2个样品，1个用于PCR阴性对照（用水做模板），6个用于标准曲线。如果做定性分析，并且只做1次重复，则标记N+4个PCR管，其中N+2个用于上步得到的N+2个样品，1个用于PCR阴性对照（用水做模板），1个用于PCR阳性对照（用第4号管的阳性对照稀释液做模板）。下面只以定量分析为例描述操作步骤。
9.在标记管中按下表加入各成分（本表只列出一次重复。样品管和阴性对照设置完毕后才设置阳性对照，阳性对照样品要等所有管子盖上盖子后最后加）：
成分                                                       N+2个制备所得样品    RT-PCR阴性对照    RT-PCR阳性对照（1-6管）
2×SYBR qRT-PCR 缓冲液                            10 μL                        10 μL                    各10 μL
甲型流感病毒N9亚型qRT-PCR引物混合液    2 μL                          2 μL                     各2 μL
 N+2个RNA模板                                            7 μL                           不加                     不加
自备超纯水                                                    不加                          7 μL                       不加
6个阳性对照稀释液                                        不加                          不加        各7 μL（1号样到1号管，2号样到2号管…）
10×SYBR qRT-PCR酶混合液v2                   1 μL                            1 μL                    1 μL
10.上机后按下面参数进行RT-PCR。
过程                   温度    时间
RT（逆转录）    50℃    10 min
预变性                95℃    5 min
PCR反应
（35个循环）     95℃    15 sec
                           60℃    60 sec（采集SYBR通道的荧光信号）
按仪器预设程序进行溶解曲线分析
注意：循环次数最好不要超过35次。

四、数据处理
11.通过溶解曲线分析的结果排除无效数据。有Ct值，但Tm值跟阳性对照Tm不一样的样品（包括对照和待测样品），归为假阳性，数据无效，不予以分析。Tm跟阳性对照Tm一致的，为有效Ct。
12.如果两种阴性对照的溶解曲线所得Tm值跟阳性对照的Tm值一样，说明环境或试剂可能有过去的qRT-PCR扩增产物污染，则此次实验无效，需要解决污染问题再进行实验。
13.如果两种阴性对照（样品制备阴性对照和qRT-PCR阴性对照）是假阳性，可以继续分析其它样品有效数据。
14.对定量检测，以阳性对照样品的浓度的log值为横轴，以有效Ct值为纵轴，绘制标准曲线。再以待测样品的有效Ct值从标准曲线上推算出样品RNA浓度的log值，再换算出待测样品的RNA浓度。
15.对定性检测，则有有效Ct值的为阳性，无有效Ct值的为阴性。

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