CAT#:JW-14-15911    
低温运输，-20℃保存

甲型流感病毒N11亚型染料法qRT-PCR试剂盒

产品及特点
甲型流感病毒（Influenza Virus A）属于正黏病毒科，其基因组由8个节段的单股负链RNA组成，长度约为136，000 nt。甲型流感病毒亚型众多，能感染多种宿主，其中N11亚型是最近在蝙蝠中新鉴定出的一种亚型。该亚型在蝙蝠中长期独立进化，扩大了流感病毒宿主范围。由于该亚型的宿主蝙蝠被称作“迁徙病毒库”，因此甲型流感病毒N11亚型的快速灵敏诊断具有重要的公共卫生学意义。本产品基于PCR原理开发，专门用于检测甲型流感病毒N11亚型。它具有下列特点：
1.一站式，用于不需要单独准备每种成分，只需要提供RNA样品。
2.基于染料法qRT-PCR检测，灵敏度比常规RT-PCR高10-100倍，可以达到至少100拷贝/反应。
3.根据甲型流感病毒N11亚型的保守基因序列设计的引物，具有良好的特异性，不会跟其它生物的RNA发生交叉反应。
4.使用一管式qRT-PCR技术，RT和PCR两步在一个试管内完成，不需要中间转移样品，降低了操作误差和可能的污染。
5.本产品既可用于定性检测，也可用于定量检测。用于定量检测时线性范围至少有5个数量级。
6.本产品足够50次20 μL体系的RT-PCR反应
7.本产品只能用于科研。

规格及成分
成份                                                                                   编号               规格           包装
2×SYBR qRT-PCR 缓冲液                                              990102a        500 μL    0.5 mL本色管
10×SYBR qRT-PCR酶混合液v2                                      990102bv2    100 μL    0.5 mL红盖管
荧光PCR专用模板稀释液                                                 180701           1 mL      1.5 mL绿盖管
甲型流感病毒N11亚型RT-PCR引物混合液                       yw14-15911    100 μL    0.5 mL白盖管
甲型流感病毒N11亚型RT-PCR阳性对照（1E7拷贝/μL）  pc14-15911    50 μL      0.5 mL黄盖管
使用手册                                                                            14-15911sc    1份           无
本产品采用五孔盒包装

运输及保存
低温运输，-20℃保存，保存期限为12个月。阳性对照需要单独放置。

自备试剂
样品RNA

使用方法
一、稀释阳性对照（以1E1-1E6这6个10倍稀释度为例。由于标准品浓度非常高，因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行）。为增加产品稳定性和避免扩散传染性病原。
1.标记6个离心管，分别为6，5，4，3，2，1。用带芯枪头分别加入45 μL荧光PCR专用模板稀释液，最好用带芯枪头，下同）。
2.换枪头，在6号管中加入5 μL 1E7拷贝/μL的阳性对照(试剂盒提供)，充分震荡1分钟，得1E6拷贝/μL的阳性对照。放冰上待用。
3.换枪头，在5号管中加入5 μL 1E6拷贝/μL的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡1分钟，得1E5拷贝/μL的阳性对照。放冰上待用。
4.换枪头，在4号管中加入5 μL 1E5拷贝/μL的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡1分钟，得1E4拷贝/μL的阳性对照。放冰上待用。
5.重复上面的操作直到得到6个稀释度的阳性对照。放冰上待用。

二、样品RNA的制备
6.如果有N个样品，必须设置N+2个提取，多出的一个是PC（样品制备阳性对照），一个是NC（样品制备阴性对照）。可以用10 μL上步制备的阳性对照梯度稀释液中的第4号（浓度为1E4拷贝/μL，10 μL相当于1万拷贝）再加上一定量的水作为制备的阳性对照，加水后其总体积跟核酸纯化试剂盒所要求的起始样品体积一样。可以用水作为核酸制备的阴性对照NC。
7.用自选方法纯化N+2个样品的RNA，本试剂盒跟市场上大多数病毒样品RNA提取试剂盒兼容，也可以选购本公司的免提取核酸释放剂。

三、设置RT-PCR反应（20μL体系，在样品制备室进行）
8.如果做定量分析并且只做1次重复，则标记N+9个PCR管，其中N+2个用于上步得到的N+2个样品，1个用于PCR阴性对照（用水做模板），6个用于标准曲线。如果做定性分析，并且只做1次重复，则标记N+4个PCR管，其中N+2个用于上步得到的N+2个样品，1个用于PCR阴性对照（用水做模板），1个用于PCR阳性对照（用第6步第4号管的阳性对照稀释液做模板）。下面只以定量分析为例描述操作步骤。
9.在标记管中按下表加入各成分（本表只列出一次重复。样品管和阴性对照设置完毕后才设置阳性对照，阳性对照样品要等所有管子盖上盖子后最后加）：
成分                                                    N+2个制备所得样品    RT-PCR阴性对照    RT-PCR阳性对照（1-6管）
2×SYBR qRT-PCR 缓冲液                             10 μL                    10 μL                    各10 μL
甲型流感病毒N11亚型qRT-PCR引物混合物    2 μL                     2 μL                      各2 μL
 N+2个RNA模板                                              6 μL                     不加                     不加
自备超纯水                                                      不加                      6 μL                    不加
6个阳性对照稀释液                                         不加                      不加            各6 μL（2号样到2号管，3号样到3号管…）
10×SYBR qRT-PCR酶混合液v2                      1 μL                     1 μL                     1 μL
10.上机后按下面参数进行RT-PCR（参数可能会因仪器不同而需优化）。
过程                    温度    时间
RT（逆转录）    50℃    30分钟
预变性                95℃    2分钟
RT - PCR反应
（35个循环）    95℃    15 秒
                          60℃    15 秒（采集SYBR通道的荧光信号）
                          72℃    15 秒
按仪器预设程序进行溶解曲线分析
注意：循环次数最好不要超过35次。

四、数据处理
11.通过溶解曲线分析的结果排除无效数据。有Ct值，但Tm值跟阳性对照Tm不一样的样品（包括对照和待测样品），归为假阳性，数据无效，不予以分析。Tm跟阳性对照Tm一致的，为有效Ct。
12.如果两种阴性对照的溶解曲线所得Tm值跟阳性对照的Tm值一样，说明环境或试剂可能有过去的qRT-PCR扩增产物污染，则此次实验无效，需要解决污染问题再进行实验。
13.如果两种阴性对照（样品制备阴性对照和qRT-PCR阴性对照）是假阳性，可以继续分析其它样品有效数据。
14.对定量检测，以阳性对照样品的浓度的log值为横轴，以有效Ct值为纵轴，绘制标准曲线。再以待测样品的有效Ct值从标准曲线上推算出样品RNA浓度的log值，再换算出待测样品的RNA浓度。
15.对定性检测，则有有效Ct值的为阳性，无有效Ct值的为阴性。

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