CAT#:JW-14-18610
低温运输，-20℃保存

杜氏利什曼虫染料法荧光定量PCR试剂盒

产品及特点
利什曼原虫是一种胞内寄生原虫，由媒介昆虫白蛉传播。寄生人体的利什曼原虫主要有杜氏利什曼原虫、硕大利什曼原虫、墨西哥利什曼原虫、巴西利什曼原虫等，其中，杜氏利什曼原虫引起的黑热病症状最重，致死率极高。本公司开发了杜氏利什曼虫基因染料法荧光定量PCR试剂盒，它具有下列特点：
1.即开即用，用户只需要提供样品DNA模板。
2.引物经过优化，灵敏性高，分析灵敏度可以达到100拷贝/反应。
3.提供阳性对照，便于区分假阴性样品。
4.特异性高，引物是根据利什曼原虫高度保守区设计，不会跟其他生物的DNA发生交叉反应。
5.本产品足够50次20μL体系的染料法荧光定量PCR反应。
6.既可用于定性，也可用于定量。用于定量时线性范围至少5个数量级。
7.本产品只能用于科研。

规格及成分
本产品采用5孔盒包装
成分                                                                                   编号          规格            包装
2×qPCR MagicMix                                                         990408         0.5 mL     0.5mL棕色管
荧光PCR专用模板稀释液                                               180701          1 mL      1.5mL绿盖管
超纯水                                                                            100935          1 mL       1.5mL蓝盖管
杜氏利什曼虫染料法qPCR引物混合液                           yw14-18610    100 μL    0.5mL白盖管
杜氏利什曼虫染料法qPCR阳性对照(1×10E7拷贝/μL)    pc18610         50 μL     0.5mL黄盖管
使用手册                                                                         14-18610sc    1份           无

运输及保存
低温运输，-20℃保存，保存期限为12个月。

自备试剂
样品DNA。

使用方法
一、制备标准曲线样品（以10E1-10E6拷贝/μL这6个10倍稀释度为例）。由于标准品浓度非常高，因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行，千万不能污染样品或本试剂盒的其他成分）。为增加产品稳定性和避免扩散传染性病原，本产品不提供活体样品做阳性对照，只提供无传染性的DNA片段作为阳性对照。
1.标记6个离心管，分别为6，5，4，3，2，1。
2.用带芯枪头分别加入45μL荧光PCR专用模板稀释液，最好用带芯枪头，下同）。
3.在6号管中加入5μL 阳性对照（其浓度为1×10E7拷贝/μL，试剂盒提供)，充分震荡1分钟，得1×10E6拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。
4.换枪头，在5号管中加入5μL 1×10E6拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡1分钟，得1×10E5拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。
5.换枪头，在5号管中加入5μL 1×10E5拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡1分钟，得1×10E4拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。
6.重复上面的操作直到得到6个稀释度的标准曲线样品。放冰上待用。

二、样品DNA的制备
7.用自选方法纯化样品的DNA，本产品跟市场上绝大多数核酸纯化产品兼容。
8.如果有N个样品，则需要进行N+2个样品提取，多出的一个用作样品制备阳性对照管、另一个用作样品制备阴性对照管。

三、设置qPCR反应（20μL体系，在样品制备室进行）
9.如果进行定量分析，则标记N+9个PCR管，其中N+2个用于上步得到的N+2个样品，1个用于PCR阴性对照，6个用于标准曲线样品。如果做定性分析，则6个标准曲线样品只选一个做（可以选4号，其余样品不变）。以下只介绍定量分析的反应设置。
10.在标记管中按下表加入各成分：
成分                                               N+2个样品管    PCR阴性对照管    标准曲线样品管（2-7管）
2×qPCR MagicMix                                    10μL            10μL               各10μL
杜氏利什曼虫染料法 qPCR引物混合液     2μL               2μL                各2μL
 N+2个待测样品DNA模板                          8μL                -                     -
自备超纯水                                                  -                   8μL                -
第7步所得标准曲线样品稀释液（1-6号）    -                    -                 各8μL（1号样到1号管，2号样到2号管…）

11.盖上盖子后上机，按下面参数进行PCR（具体PCR参数可以根据仪器不同而自行优化）
过程                  温度    时间
预变性              95℃    5 min
PCR反应
（40个循环）  95℃    15 sec
                        60℃    1 min（采集SYBR通道的荧光信号）
按仪器预设程序进行熔解曲线分析

四、数据处理
12.通过溶解曲线分析的结果排除无效数据。有Ct值，但Tm值跟阳性对照Tm不一样的样品（包括对照和待测样品），归为假阳性，数据无效，不予以分析。Tm跟阳性对照Tm一致的，为有效Ct。
13.如果两种阴性对照的溶解曲线所得Tm值跟阳性对照的Tm值一样，说明环境或试剂可能有过去的PCR扩增产物污染，则此次实验无效，需要解决污染问题再进行实验。
14.如果两种阴性对照（样品制备阴性对照和PCR阴性对照）是假阳性，可以继续分析其它样品有效数据。
15.对定量检测，以阳性对照样品的浓度的log值为横轴，以有效Ct值为纵轴，绘制标准曲线。再以待测样品的有效Ct值从标准曲线上推算出样品DNA浓度的log值，再换算出待测样品的DNA浓度。
16.对定性检测，则有有效Ct值的为阳性，无有效Ct值的为阴性。

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