CAT#:JW-14-10200
低温运输，-20℃保存

丁型肝炎病毒染料法qRT-PCR试剂盒

产品及特点
丁型肝炎病毒（Hepatitis Delta Virus，HDV）是一种缺陷病毒，必须在HBV或其他嗜肝DNA病毒的辅助下才能复制增殖。HDV与HBV重叠感染后，可促使肝损害加重，并易发展为慢性活动性肝炎、肝硬化和重型肝炎。HDV的感染呈世界性分布，但主要分布于南意大利和中东等地区，主要通过输血、密切接触和母婴传播。HDV给人类健康造成重大威胁，因此灵敏快捷的诊断产品具有重要的意义。本产品基于PCR原理开发。它具有下列特点：
1.一站式，用于不需要单独准备每种成分，包括引物和对照。
2.根据HDV的保守基因序列设计的引物，具有良好的特异性。
3.基于染料法qRT-PCR检测，灵敏度比常规RT-PCR高10-100倍，可以达到至少1000拷贝/反应。
4.使用一管式qRT-PCR技术，RT和PCR两步在一个试管内完成，不需要中间转移样品，降低了操作误差和可能的污染。
5.本产品足够50次20uL体系的RT-PCR。
6.本产品只能用于科研，不能用于临床。

规格及成分
本产品采用五孔盒包装
成  份                                                                                    编 号         规格            包装
2×SYBR qRT-PCR 缓冲液                                              190101a        500 uL    0.5 mL本色管
10×SYBR qRT-PCR酶混合液v2                                      190101b        50 uL      0.5 mL红盖管
荧光PCR专用模板稀释液                                                 180701            1mL    1.5 mL绿盖管
丁型肝炎病毒染料法qRT-PCR引物干粉                            yw14-10200    50次    0.5 mL白盖管
丁型肝炎病毒染料法RT-PCR阳性对照(1×10E7拷贝/mL)   pc14-10200    50 uL    0.5 mL黄盖管
使用手册                                                                            14-10200sc      1份           无
注意：引物干粉在使用前需要短暂离心，然后在离心管中加入110 mL的超纯水充分混匀后再使用，未用完的需要-20℃保存。

运输及保存
低温运输，-20℃保存，保存期限为12个月。阳性对照需要因易污染其他成分需要单独放置。本产品不提供活体样品做阳性对照，只提供DNA片段作为阳性对照。需要RNA阳性对照的需要单独订购。

自备试剂
超纯水，样品RNA。

使用方法
一、稀释阳性对照（以10E1-10E6这6个10倍稀释度为例。由于标准品浓度非常高，因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行，千万不能污染样品或本试剂盒的其他成分）。为增加产品稳定性和避免扩散传染性病原，本产品不提供活体样品做阳性对照，只提供无传染性的的DNA片段作为阳性对照。
1.标记6个离心管，分别为6，5，4，3，2，1。用带芯枪头分别加入45 μL 荧光PCR专用模板稀释液，最好用带芯枪头，下同）。
2.在6号管中加入5 μL 1×10E7拷贝/μL 的阳性对照(本试剂盒提供)，充分震荡1分钟，得1×10E6拷贝/μL的阳性对照。放冰上待用。
3.换枪头，在5号管中加入5 μL 1×10E6拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡1分钟，得1×10E5拷贝/μL的阳性对照。放冰上待用。
4.换枪头，在4号管中加入5 μL 1×10E5拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡1分钟，得1×10E4拷贝/μL的阳性对照。放冰上待用。
5.重复上面的操作直到得到6个稀释度的阳性对照。放冰上待用。

二、样品RNA的制备
6.如果有N个样品，必须设置N+2个提取，多出的一个是PC（样品制备阳性对照），一个是NC（样品制备阴性对照）。可以用10μL上步制备的阳性对照梯度稀释液中的第4号（浓度为1×10E4拷贝/μL，10μL相当于1万拷贝）再加上一定量的水作为制备的阳性对照（加水后其总体积跟样品一样，样品体积多少取决于所用试剂盒的要求）。可以用水作为制备的阴性对照。
7.用自选方法纯化N+2个样品的RNA，本试剂盒跟市场上大多数病毒RNA提取试剂盒兼容。也可以选购本公司的免提取核酸释放剂。

三、设置RT-PCR反应（20μL体系，在样品制备室进行）
8.如果只做1次重复，则标记N+9个PCR管，其中N+2个用于上步得到的N+2个样品，1个用于RT-PCR阴性对照，6个用于做标准曲线的阳性对照。
9.在标记管中按下表加入各成分（本表只列出一次重复。样品管和阴性对照设置完毕后才设置阳性对照，阳性对照样品要等所有管子盖上盖子后最后加）：
成分                                                       N+2个制备所得样品    RT-PCR阴性对照    RT-PCR阳性对照（1-6管）
2×SYBR qRT-PCR 缓冲液                               10 μL                    10 μL                           各10 μL
10×SYBR qRT-PCR酶混合液v2                        1 mL                    1 mL                             各1 mL
丁型肝炎病毒染料法qRT-PCR引物混合液        2 mL                      2 mL                            2 mL
N+2个RNA模板                                                7 mL                        不加                            不加
自备超纯水                                                       不加                          7 mL                           不加
6个阳性对照稀释液                                           不加                    不加            各7 μL（2号样到2号管，3号样到3号管…）
10.上机后按下面参数进行RT-PCR（参数可能会因仪器不同而需优化）。
过程                       温度    时间
RT（逆转录）    50℃    30 min
预变性                94℃    10 min
RT-PCR反应
（35个循环）    95℃    15 sec
                          60℃    60 sec（采集SYBR通道的荧光信号）
按仪器预设程序进行溶解曲线分析
注意：循环次数最好不要超过35次。

四、数据处理
11.通过溶解曲线分析的结果排除无效数据。有Ct值，但Tm值跟阳性对照Tm不一样的样品（包括对照和待测样品），归为假阳性，数据无效，不予以分析。Tm跟阳性对照Tm一致的，为有效Ct。
12.如果两种阴性对照的溶解曲线所得Tm值跟阳性对照的Tm值一样，说明环境或试剂可能有过去的qRT-PCR扩增产物污染，则此次实验无效，需要解决污染问题再进行实验。
13.如果两种阴性对照（样品制备阴性对照和qRT-PCR阴性对照）是假阳性，可以继续分析其它样品有效数据。
14.对定量检测，以阳性对照样品的浓度的log值为横轴，以有效Ct值为纵轴，绘制标准曲线。再以待测样品的有效Ct值从标准曲线上推算出样品RNA浓度的log值，再换算出待测样品的RNA浓度。
15.对定性检测，则有有效Ct值的为阳性，无有效Ct值的为阴性。

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