CAT#:JW-13-24800
低温运输，-20℃保存

诺如病毒RT-PCR试剂盒

产品及特点
诺如病毒(Norwalk Viruses，NV)也叫Norovirus（NoV），是一种RNA病毒，是一组形态相似、抗原性略有不同的病毒颗粒。其中诺如病毒1型、2型和4型可以感染人。诺如病毒感染性腹泻在全世界范围内均有流行，全年均可发生感染，感染对象主要是成人和学龄儿童，寒冷季节呈现高发。美国每年在所有的非细菌性腹泻暴发中，60-90%是由诺如病毒引起。荷兰、英国、日本澳大利亚等发达国家也都有类似结果。在中国5岁以下腹泻儿童中，诺如病毒检出率为15%左右，血清抗体水平调查表明中国人群中诺如病毒的感染亦十分普遍。诺如病毒感染性腹泻属于自限性疾病，没有疫苗和特效药物，因此灵敏快捷地检测诺如病毒具有重要的意义。本产品就是为满足此需求而开发的、专门检测诺如病毒的常规RT-PCR试剂盒，它具有下列特点：
1.即开即用，用户只需要提供样品RNA模板。
2.产品经过精心优化，分析灵敏性能到达100拷贝/反应。
3.提供阳性对照，便于区分假阴性样品。
4.特异性高，引物是根据诺如病毒RNA高度保守区设计，只能检测诺如病毒，不会跟除此之外的其他生物的RNA发生交叉反应。
5.本产品足够50次20μL体系的RT-PCR反应。
6.本产品只能用于定性实验，不能用于定量实验。
7.本产品只能用于科研。

规格及成分
成份                                                                    编号                               规格            包装材料
2×RT-PCR Buffer                                                91202a                        500 μL    0.5mL绿盖管
10×RT-PCR酶混合液                                           91202b                        50μL      0.5mL红盖管
超纯水                                                                   210806                       1 mL      1.5mL蓝盖管
诺如病毒RT-PCR引物混合液                                yw13-24800                100 μL    0.5mL白盖管
诺如病毒RT-PCR阳性对照（1×10E4拷贝/μL）    pc24800-XXXXXXX    250 μL    0.5mL黄盖管
使用手册                                                               13-24800sc                   1份            1份
注：为避免扩散传染性病原，本产品不提供活体样品做阳性对照，只提供专一的DNA片段作为阳性对照。如果需要RNA片段作为阳性对照的需要单独定制。

运输及保存
低温运输，-20℃保存，保存期限为12个月。

自备试剂
样品RNA

使用方法
一、样品RNA的制备
1.如果有N个样品，必须设置N+2个提取反应，多出的两个中一个是PC（样品制备阳性对照），一个是NC（样品制备阴性对照）。可以用10μL试剂盒提供的RT-PCR阳性对照（1×10E4拷贝/μL）再加上一定量的水作为制备的阳性对照，加水后其总体积跟核酸纯化试剂盒所要求的起始样品体积一样。可以用水作为制备的阴性对照。
2.用自选方法纯化上述N+2个样品的RNA。本试剂盒跟市场上大多数样品RNA提取试剂盒兼容，也可以选用本公司的相关的核酸提取试剂盒。

二、设置RT-PCR反应（20μL体系）
3.标记N+4个PCR管，其中N+2个用于上步得到的RNA样品，额外增加的两个管一个用于RT-PCR阳性对照，另一个用于RT-PCR阴性对照。按照下表在各PCR管中加入下列成分：
成份                                                           N+2个样品管    RT-PCR阴性对照    RT-PCR阳性对照
2×RT-PCR Buffer                                            各10 μL                10 μL                    10 μL
10×RT-PCR酶混合液                                      1 μL                     1 μL                      1 μL
诺如病毒RT-PCR引物混合液                           各2 μL                 2 μL                      2 μL
制备的N+2个RNA样品                                     各7 μL                不加                      不加
超纯水                                                               不加                   7 μL                      不加
诺如病毒RT-PCR阳性对照（1×10E4拷贝/μL）不加                   不加                       7 μL
4.上机进行RT-PCR，RT-PCR反应参数为:
过程                 温度      时间
逆转录              42℃    55分钟
预变性              95℃    5分钟
PCR反应
（30个循环）   95℃    15秒
                        55℃    60秒
                        65℃    60秒
延伸                 72℃    10分钟

三、电泳分析
5.取10uL扩增产物进行常规琼脂糖电泳，检测扩增效果，由于扩增产物较短，建议用1.5%-2.0%的琼脂糖凝胶。
6.阳性样品预期得到的扩增产物长度为110bp。如果两个阴性对照（样品制备阴性对照或RT-PCR阴性对照）有此扩增产物，说明环境污染，则整个实验无效，不需要分析实验结果。
7.如果所有样品和RT-PCR阳性对照均无此扩增产物，则说明有系统性的问题（试剂，设备，程序，操作等），需要重复并排查原因。
8.如果没有上述两种情况，则实验有效，可以分析样品的扩增结果。N+2个样品中扩增产物的判断为阳性，无则判定为阴性。

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