CAT#:JW-13-67740
低温运输，-20℃保存

鸟分枝杆菌副结核亚种电泳法PCR试剂盒

产品及特点
鸟分枝杆菌(Mycobacterium avium subsp．paratuberculosis) 是一种环境分枝杆菌，在自然界中普遍存在，可从自然来源的水、土壤、植物中分离得到。鸟分枝杆菌能够感染多种禽群，引起以肠道、肝脏和脾脏结核性结节为特征的病变，也可以感染人、猪、牛、羊等动物。鸟分枝杆菌具体可分为4个亚种，即引起禽结核病的鸟分枝杆菌禽亚种(M．avium subsp．avium) ; 从环境、人及猪分离出的鸟分枝杆菌人猪型亚种(M．avium subsp．hominissuis) ; 引起牛羊等反刍动物副结核病的鸟分枝杆菌副结核亚种(M． avium subsp．paratuberculosis) ; 可导 致林鸽禽结核病的鸟分枝杆菌森林土壤亚种 (M．avium subsp．silvaticum) 。传统的血清学分型方法不仅耗时、存在安全隐患，而且只能简单的将鸟分枝杆菌复合体( M．avium complex) 分为鸟分枝杆菌和胞内分枝杆菌两大类，不能反映真实情况，因此准确的亚种鉴定对禽结核病的诊断和防控具有重要意义。本产品就是为满足此需求而开发的、专门检测鸟分枝杆菌副结核亚种的PCR试剂盒，它具有下列特点：
1.即开即用，用户只需要提供样品DNA模板。
2.产品经过精心优化，分析灵敏性能到达100拷贝/反应。
3.提供阳性对照，便于区分假阴性样品。
4.特异性高，引物是根据鸟分枝杆菌副结核亚种DNA高度保守区设计，in silico分析发现它只能检测鸟分枝杆菌副结核亚种，不会跟除此之外的其他生物的DNA发生交叉反应。
5.本产品足够50次20μL体系的常规PCR反应。
6.本产品只能用于定性实验，不能用于定量实验。
7.本产品只能用于科研。

规格及成分
本产品采用5孔盒包装
成                                                                                              编号           规格            包装材料
PCR MagicMix 3.0                                                                   90805        0.5 mL     0.5 mL（本色盖）
超纯水                                                                                    210806        1 mL        1.5 mL（蓝盖管）
鸟分枝杆菌副结核亚种PCR引物混合液                            yw13-67740      100 μL     0.5mL（白盖管）
鸟分枝杆菌副结核亚种PCR阳性对照（1×10E4拷贝/μL）     Pc67740        250 μL    0.5mL（黄盖管）
使用手册                                                                            13-67740sc       1份           1份
注：为避免扩散传染性病原，本产品不提供活体样品做阳性对照，只提供专一的DNA片段作为阳性对照。

运输及保存
低温运输，-20℃保存，保存期限为12个月。

自备试剂
样品DNA

使用方法
一、样品DNA的制备
1.如果有N个样品，必须设置N+2个提取反应，多出的两个中一个是PC（样品制备阳性对照），一个是NC（样品制备阴性对照）。可以用试剂盒提供的PCR阳性对照（1×10E4拷贝/μL，本试剂盒提供）10μL加上一定量的水作为制备的阳性对照（加水后其总体积跟核酸制备试剂盒所要求的起始样品体积一样）。可以直接用水作为制备的阴性对照。
2.用自选方法纯化上述N+2个样品的DNA。本试剂盒跟市场上大多数样品DNA提取试剂盒兼容。也可以选用本公司的相关的核酸提取试剂盒。

二、设置PCR反应（20μL体系）
3.标记N+4个PCR管，其中N+2个用于上步得到的DNA样品，额外增加的两个管一个用于PCR阳性对照，另一个用于PCR阴性对照。按照下表在各PCR管中加入下列成分：
成份                                                    N+2个样品管    PCR阴性对照    PCR阳性对照
PCR MagicMix 3.0                                   各10 μL          10 μL                   10 μL
鸟分枝杆菌副结核亚种PCR引物混合液    各2 μL           2 μL                     2 μL
制备的N+2个DNA样品                               各8 μL         不加                      不加
超纯水                                                        不加                8 μL                    不加
鸟分枝杆菌副结核亚种PCR阳性对照（1×10E4拷贝/μL）    不加    不加    8 μL
4.上机进行PCR，PCR反应参数为:
过程               温度    时间
预变性            95℃    5分钟
PCR反应
（30个循环） 95℃    15秒
                       55℃    60秒
                       65℃    60秒
延伸                72℃    10分钟

三、电泳分析
5.取10μL扩增产物进行常规琼脂糖电泳，检测扩增效果，由于扩增产物较短，建议用1.5%-2.0%的琼脂糖凝胶。
6.阳性样品预期得到的扩增产物长度为110bp。如果两个阴性对照（样品制备阴性对照或PCR阴性对照）有此扩增产物，说明环境污染，则整个实验无效，不需要分析实验结果。如果所有样品和PCR阳性对照均无此扩增产物，则说明有系统性的问题（试剂，设备，程序，操作等），需要重复并排查原因。
7.如果没有上述两种情况，则实验有效，可以分析样品的扩增结果。N+2个样品中扩增产物的判断为阳性，无则判定为阴性。

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