CAT#:JW-13-99047yd
低温运输，-20℃保存

川贝母电泳法PCR鉴定试剂盒（PCR-RFLP药典法）

产品及特点
川贝母（Bulbus Fritillariae cirrhosae）是百合科贝母属的川贝母、甘肃贝母、暗紫贝母、瓦布贝母、梭砂贝母和太白贝母6种贝母的干燥鳞茎，有化痰止咳、清热润肺、散结消痈之功效。由于川贝母的药用价值高、疗效显著、市场需求量大，故常有用5种其他贝母（如浙贝母、平贝母、伊贝母、湖北贝母等）混充川贝母的现象，因此精准检测川贝母真假具有重要意义。目前川贝母鉴定最常且最准确的由 2015年版《中国药典》收录的PCR-RFLP法，该方法为PCR后再进行酶切电泳分析，本公司根据中国药典的方法开发了本产品，它具有下列特点：
1.即开即用，用户只需要提供样品DNA模板。
2.产品经过精心优化，分析灵敏度能到达100拷贝/反应。
3.提供阳性对照，便于区分假阴性实验。
4.特异性高，引物是根据川贝母DNA高度保守区设计，生物信息学分析发现它只能检测川贝母，不会跟除此之外的其他生物的DNA发生交叉反应。
5.本产品足够50次20μL体系的常规PCR反应。
6.本产品只能用于定性实验，不能用于定量实验。
7.本产品只能用于科研。

规格及成分
本产品采用五孔盒包装
成  份                                     编号           规格            包装
2×PCR MasterMix            990805           0.5 mL    0.5 mL本色管
川贝母PCR引物干粉    yw13-99047yd    50次       0.5mL白盖管
川贝母PCR阳性对照
（1E4拷贝/μL）            pc99047yd         250 μL    0.5mL黄盖管
Sma I（10U/μL）           13-99047a        50 μL      0.5mL红盖管
10×酶切缓冲液               13-99047b        100 μL    0.5mL本色管
使用手册                    13-99047ydsc       1份            1份
注：引物干粉在使用前需要短暂离心，然后在离心管中加入110uL的超纯水充分混匀后再使用，未用完的需要-20℃保存。

运输及保存
低温运输，-20℃保存，保存期限为24个月。

自备试剂
样品DNA，超纯水。

使用方法
一、样品DNA的制备
1.如果有N个样品，必须设置N+2个提取反应，多出的两个中一个是PC（样品制备阳性对照），一个是NC（样品制备阴性对照）。可以用试剂盒提供的PCR阳性对照（1E4拷贝/μL，本试剂盒提供）10μL加上一定量的水作为制备的阳性对照（加水后其总体积跟核酸制备试剂盒所要求的起始样品体积一样）。可以直接用水作为制备的阴性对照。
2.用自选方法纯化上述N+2个样品的DNA。本试剂盒跟市场上大多数样品DNA提取试剂盒兼容。也可以选用本公司的相关的核酸提取试剂盒。

二、设置PCR反应（20μL体系）
3.标记N+4个PCR管，其中N+2个用于上步得到的DNA样品，额外增加的两个管一个用于PCR阳性对照，另一个用于PCR阴性对照。按照下表在各PCR管中加入下列成分：
成分                            N+2个样品管    PCR阴性对照    PCR阳性对照
2×PCR MasterMix                各10 μL        10 μL                10 μL
川贝母PCR引物混合液         各2 μL            2 μL                2 μL
N+2个样品DNA模板             各8 μL                -                 -
PCR阴性对照（水）                -                  8 μL                 -
川贝母PCR阳性对照    
（1E4拷贝/μL）                        -                   -                    8 μL
4.按下表设置PCR反应：
过程                温度         时间
预变性             95℃       5 min
PCR反应
（35个循环）   95℃        30 sec
                        55-58℃    30 sec
                          72℃       30 sec
最后延伸           72℃         5 min
5.取上述PCR反应液，进行酶切反应。按照下表在各管中加入下列成分：
成分                               用量
10×酶切缓冲液               2 μL
Sma I（10U/μl）            0.5 μL
上述PCR反应液               6 μL
水                                    11.5 μL
Sma I酶切体系总体积     20 μL
6.30℃水浴酶切反应2小时。

三、电泳检测
7.  取8uL酶切产物进行常规琼脂糖电泳检测，由于酶切产物较短，建议用1.5%的琼脂糖凝胶。
8.  供试品凝胶电泳图谱中，在与川贝母阳性对照图谱相应的位置上，在100～250bp应有两条DNA条带，空白对照无条带。

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