CAT#:JW-12-83600
低温运输，-20℃保存

真菌通用可视化染料LAMP试剂盒

产品及特点
真菌（Fungus）是一种具真核的、产孢的、无叶绿体的真核生物。包含霉菌、酵母、蕈菌以及其他人类所熟知的菌菇类。已经发现了十二万多种真菌。真菌独立于动物、植物和其他真核生物，自成一界。真菌的细胞有含甲壳素，能通过无性繁殖和有性繁殖的方式产生孢子。由于真菌广泛存在于自然界，因此有重多场景需要人们对其进行快速检测，为此本公司开发了真菌通用可视化染料LAMP试剂盒，它具有下列特点:
1.即开即用，用户只需要提供样品DNA模板。
2.恒温扩增，可以不需要荧光PCR等贵重仪器。
3.含可见光染料，可以用金属浴和水浴扩增用可见光肉眼判断结果。
4.检测灵敏性一般比PCR高10倍以上。
5.特异性高，引物是根据真菌高度保守区设计，不会跟其他生物的DNA发生交叉反应。
6.一般30分钟内出结果，比PCR快。
7.上样量大，对20μL的反应体系，最大样品加样量高达到14 μL。
8.内含的dUTP-UNG可防交叉污染。
9.提供无传染性的阳性对照，便于分析实验结果。
10.本产品只能用于定性分析，不推荐用于定量分析。
11.本产品足够50次20μL体系的的可视化LAMP扩增
12.本产品只能用于科研。

规格及成分
本产品采用5孔盒包装
成分                                    编号                规格     包装材料
4×LAMP MasterMix
(可视化染料法，待加酶)    211221a        200 μL    0.5 mL绿盖管
Bst DNA聚合酶2.0           11-220319        50 μL    1.5 mL红盖管
真菌通用LAMP
引物混合液                     yw16-83600      200 μL    0.5 mL白盖管
真菌通用PCR阳性对照
(1×10E4拷贝/μL)    pc83600-NW_022983864.1    250 μL    0.5 mL黄盖管
超纯水                            210806                1 mL      1.5 mL蓝盖管
使用手册                   12-83600sc              1份            无

运输及保存
低温运输，-20℃保存，保存期限为12个月。

自备试剂
样品DNA。

使用方法
一、样品DNA的制备
1.用自选方法纯化样品DNA，本试剂盒跟市场上大多数DNA提取试剂盒兼容，包括本公司的免提取的核酸释放剂。
2.如果有N个样品，则需要做N+2个样品制备，包括一个样品制备阳性对照（PC）和一个样品制备阴性对照（NC）。PC用10μL本试剂盒提供的阳性对照（1×10E4拷贝/μL）加一定量的水作为样品制备PC，加水后的总体积跟所用核酸纯化试剂盒所要求的起始样本体积一致。NC用水替代。

二、LAMP反应（20μL体系）
3.反应设置：第一次使用时请把所有Bst DNA聚合酶2.0（50μL，本试剂盒提供）加入到4×LAMP MasterMix（可视化染料法，待加酶）中，轻柔颠倒20次充分混匀，然后再取用。如果有N+2个DNA纯化样品，则最好设置N+4个LAMP扩增，增加LAMP扩增阳性对照和LAMP扩增阴性对照各1个。在N+4个PCR管中加入下列成分：
成分                                    N+2个样品管    LAMP阴性对照    LAMP阳性对照
4×LAMP MasterMix
(可视化染料法，待加酶)    各5 μL                  5 μL                       5 μL
20×真菌通用LAMP
引物混合液                       各1 μL                  1 μL                       1 μL
N+2个样品DNA                各14 μL                不加                       不加
超纯水                               不加                   14 μL                        不加
真菌通用LAMP阳性对照（1×10E4拷贝/μL）    不加    不加        14 μL
4.如果使用金属浴或水浴保温，没有热盖，则每个反应管中加入50μL自备的PCR级石蜡油，否则保温期间反应体系的水分会蒸发到管盖下方凝集，反应体积变化，会严重影响反应效率，增加假阳性率。最后置于65℃保温60分钟进行扩增。
5.如果使用常规PCR仪进行LAMP反应，设置程序时必须打开热盖，设置成65℃保温60分钟进行扩增。

三、结果分析
6.电泳分析：由于取样时非常容易产生气溶胶污染，污染实验环境并且非常难清除污染，所以强烈建议不要采取此方法分析实验结果。即使使用，也要在不同的房间，使用不同的移液枪操作。具体做法是取10μL LAMP扩增产物跟自备上样液混合后进行2%琼脂糖凝胶电泳。LAMP阳性对照必须有正常LAMP条带（200bp左右的梯形扩增产物），LAMP阴性结果必须无条带，否则实验结果无效。如果LAMP阳性对照和阴性对照结果正常，再分析待测样品。典型的电泳结果见下表，奇数样为阴性结果，偶数样为阳性结果：

7.可将光（肉眼）分析：样品制备阳性对照和LAMP阳性对照的反应液将呈蓝色，样品制备阳性对照和LAMP阳性对照的反应液将呈淡蓝色或无色，否则提取实验或扩增实验无效。如果阳性和阴性对照结果正常，则实验有效，可以分析样品的情况。样品管的颜色接近扩增阳性对照管则说明样品为阳性，如果接近阴性对照则说明待测样品为阴性。典型的可将光检测结果见左图（9为阴性，10为阳性）。

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