CAT#:JW-12-4540
低温运输，-20℃保存

烟草花叶病毒可视化染料RT-LAMP试剂盒

产品及特点
烟草花叶病毒（Tobacco Mosaic Virus, TMV）属于植物杆状病毒科烟草花叶病毒属，为正义单链RNA病毒，基因组全长为6395 nt。烟草花叶病毒的传染性和存活率比较高，在自然界中主要通过汁液摩擦传播，同时也通过蚜虫、土壤以及种子传播，不同寄主被侵染后表现出不同的症状，侵染烟草时表现出黄绿相间的花叶症状，严重时形成疱斑，被侵染烟草的烟叶产量和品质会受到明显影响。烟草花叶病毒对烟草、黄瓜、辣椒和观赏植物等125种植物造成了巨大的损害。因此，快速检测烟草花叶病毒具有重要的意义。为此，本公司基于可视化RT-LMAP技术，开发了简单快捷的烟草花叶病毒可视化RT-LAMP检测试剂盒，它具有下列特点：
1.即开即用，用户只需要提供RNA样品。
2.恒温扩增，可以不需要荧光PCR等贵重仪器。
3.检测灵敏度一般比RT-PCR高10倍以上。
4.特异性高，根据烟草花叶病毒保守序列设计6条特异引物，不会跟其他生物的RNA发生交叉反应。
5.一般30分钟内出结果，比PCR快。
6.上样量大，对20 μL的反应体系，最大样品加样量高达到14 μL。
7.内含的dUTP-UNG可防交叉污染。
8.提供无传染性的阳性对照，便于分析实验结果。
9.本产品只能用于定性分析，不推荐用于定量分析。
10.本产品足够50次20 μL体系的可视化RT-LAMP扩增。
11.本产品只可用于科研。

规格及成分
本产品采购5孔盒包装
成份                                           编号                规格       包装
4×RT-LAMP MasterMix
（可视化染料法，待加酶）      211221a        200 μL     0.5 mL绿盖管
逆转录酶-扩增酶混合液            211208b        50 μL       0.5 mL红盖管
20×烟草花叶病毒
LAMP引物干粉                        yw12-4540     50 次        0.5 mL白盖管
烟草花叶病毒
阳性对照（1E4拷贝/μL）      pc12-4540       250 μL     0.5 mL黄盖管
超纯水                                    210806           1 mL        1.5 mL蓝盖管
使用手册                               12-4540sc        1 份            无
注：引物-探针干粉在使用前需要短暂离心，然后在离心管中加入200 mL超纯水充分混匀后再使用，未用完的需要-20℃保存。

运输及保存
低温运输，-20℃保存，保存期限为一年。

自备物品
待测样品RNA。

使用方法
一、样品RNA的制备
1.用自选方法纯化样品RNA，本试剂盒跟市场上大多数RNA提取试剂盒兼容，包括本公司的免提取的核酸释放剂。
2.如果有N个样品，则需要做N+2个样品制备，包括一个样品制备阳性对照（PC）和一个样品制备阴性对照（NC）。PC用10 μL本试剂盒提供的阳性对照（1E4拷贝/μL）加一定量的水作为样品制备PC，加水后的总体积跟所用核酸纯化试剂盒所要求的起始样本体积一致。NC用水替代。

二、RT-LAMP反应（20 μL体系）
3.反应设置：第一次使用时请把所有逆转录酶-扩增酶混合液（50 μL，本试剂盒提供）加入到4×RT-LAMP MasterMix（可视化染料法，待加酶）中，轻柔颠倒20次充分混匀，然后再取用。如果有N+2个RNA纯化样品，则最好设置N+4个RT-LAMP扩增，增加RT-LAMP扩增阳性对照和RT-LAMP扩增阴性对照各1个。在N+4个PCR管中加入下列成分：
成分                                   N+2个样品管    RT-LAMP阴性对照    RT-LAMP阳性对照
4×RT-LAMP MasterMix
（可视化染料法，加酶后）     各5 μL                5 μL                       5 μL
20×烟草花叶病毒
LAMP引物混合液                     各1 μL                1 μL                        1 μL
N+2个样品RNA                        各14 μL             不加                         不加
超纯水                                      不加                  14 μL                       不加
烟草花叶病毒阳性对照
（1E4拷贝/μL）                        不加                 不加                        14 μL
4.使用常规PCR仪进行LAMP反应，设置程序时必须打开热盖，设置成65℃保温60分钟进行扩增。

三、结果分析
5.电泳分析：由于取样时非常容易产生气溶胶污染，污染实验环境并且非常难清除污染，所以强烈建议不要采取此方法分析实验结果。即使使用，也要在不同的房间，使用不同的移液枪操作。具体做法是取10 μL RT-LAMP扩增产物跟自备上样液混合后进行2%琼脂糖凝胶电泳。RT-LAMP阳性对照必须有正常RT-LAMP条带（200 bp左右的梯形扩增产物），RT-LAMP阴性结果必须无条带，否则实验结果无效。如果RT-LAMP阳性对照和阴性对照结果正常，再分析待测样品。典型的电泳结果见下表，奇数样为阴性结果，偶数样为阳性结果：

6.可将光（肉眼）分析：样品制备阳性对照和RT-LAMP阳性对照的反应液将呈蓝色，样品制备阳性对照和RT-LAMP阳性对照的反应液将呈淡蓝色或无色，否则提取实验或扩增实验无效。如果阳性和阴性对照结果正常，则实验有效，可以分析样品的情况。样品管的颜色接近扩增阳性对照管则说明样品为阳性，如果接近阴性对照则说明待测样品为阴性。典型的可将光检测结果见左图（9为阴性，10为阳性）。

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