CAT#:JW-11-MK220950
低温运输和保存

死细菌活细菌染色试剂盒（SYTO9-PI法）

产品及特点
活细菌死细菌双染试剂盒（SYTO9/PI法）是利用SYTO9绿色核酸染料和碘化丙啶（PI）红色荧光核酸染料来进行细菌活力检测的试剂盒，其原理是SYTO9能对所有待测细菌（活菌+死菌）进行标记，而PI只能渗透进入到细胞膜受损的死菌，故在活菌中只有SYTO染料，故呈绿色荧光，而在死菌中同时有SYTO9和PI两种染料，故细菌呈红色荧光。在荧光显微镜下通过颜色即可分开两类细菌，通过检测两种荧光的比例可以反推出样本中活菌和死菌的比例。本方法原理示意图如下：

本产品基于上述原理开发，它具有下列特点：
1.适用于各种细菌，包括枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、肺炎克雷伯氏菌等等。
2.两种染料的最大激发和发射波长分别是480/500 nm（SYTO9）和490/635 nm（PI）。
3.本试剂盒兼容于荧光显微镜，荧光光度计、荧光酶标仪、流式细胞仪或其它荧光检测仪器。
4.本产品足够40次1 mL细菌的荧光显微镜检测和流式细胞仪检测，200次100 μL菌液的荧光酶标仪检测。
5.用于定量时需要自备制作标准曲线的细菌。
6.本产品只能用于科研。

规格及成分
成份                                              编号              规格    包装
SYTO9溶液，3.34 mM        11-MK220950a    60 μL    0.5 mL棕色管
PI溶液，20 mM                    11-MK220950b    60 μL    0.5 mL棕色管
Mounting oil                         11-MK220950c    2 mL     2.0 mL本色管
使用手册                             11-MK220950sc    1份               1份
本产品使用五孔盒包装
运输及保存

低温运输，-20℃避光保存，有效期一年。

自备试剂
0.85% NaCl溶液，细菌培养基（制作标准曲线用，培养基跟所测细菌种类相关）

使用方法
一、用前须知
1.第一次使用可将SYTO9和PI室温融化，低速短暂离心，然后根据单次用量分装成小份密封后置于≤-20℃避光保存。
2.试剂C（Mounting oil）用于将细菌固定在膜上，25℃的折射率是1.517±0.003。不要误用作显微镜的浸油（Immersion oil）。
3.SYTO9和PI均能够跟核酸结合，PI是已知的潜在诱变剂，目前没有数据表明SYTO9的诱变性或毒性，两种试剂使用都需做恰当防护。含此类染料的试剂经活性炭吸附后再进行废液处理。活性炭之后经焚烧来破坏染料。

二、制备活菌和死菌悬液（制作标准曲线用或对照用）
4.用30 mL营养肉汤培养大肠杆菌或其他细菌，使其生长至对数生长后期。
5.于10,000×g离心10分钟，吸弃上清液。
6.用2 mL自备的0.85% NaCl溶液重悬细菌沉淀。
7.取1 mL重悬菌液加入到20 mL 0.85% NaCl溶液中（用作活细菌对照），另外1 mL加入到20 mL 70% 异丙醇中（用作死细菌对照）。
8.两管样品于室温孵育1小时，每隔15分钟颠倒混匀一次。
9.两管样品于10,000×g离心10分钟。
10.分别用20 mL 0.85% NaCl溶液重悬两管细菌沉淀。
11.于10,000×g离心10分钟，吸弃上清液。
12.分别用10 mL 0.85%NaCl溶液重悬两管样品得到活菌和死菌样品。
13.分别取3 mL菌液测定OD670的值（可用玻璃或丙烯酸酯比色皿，1cm路径）。
14.根据不同后续实验进行下面的操作。

三、荧光显微镜检测
15.在离心管内将SYTO9溶液和PI溶液按1：1的体积比混匀得到染料混合液。
16.取1 mL活菌悬液和1 mL死菌悬液（来于第13步），各加入3 μL染料混合液混匀，此作为活菌和死菌对照。同时，用0.85% NaCl溶液将待测样品制备成1mL悬液，也加入3 μL染料混合液混匀。
17.室温避光孵育15分钟。
18.各取5 μL染色的细菌悬液到载玻片上，并盖上18 mm方形盖玻片后在荧光素滤光片下观察活菌（绿色荧光）和Texas Red滤光片下观察死菌（红色荧光）。
四、荧光光度计检测（以大肠杆菌为例）
19.调整大肠杆菌活菌悬液和死菌悬液，使其密度均为1E8个细菌/mL（OD670=0.03）。
20.按下表制备标准曲线样本：
样本号    加入活菌mL    加入死菌mL    活菌比
1               0                    3                     0%
2               0.75                2.25               25%
3               1.5                  1.5                  50%
4               2.25                0.75                75%
5                3                    0                    100%
21.如果有N个待测样品，则准备（N+6）×9 μL染料混合液A。染料混合液A由SYTO9溶液和PI溶液1：1充分混匀而成。多准备的5个用于标准曲线样品，多1个的量为富余量。
22.在N个样品管和1-5号标准曲线样品内各加入9 μL染料混合液A，用枪上下吹打数次使其混匀。
23.室温避光孵育15分钟。
24.以485 nm为激发波长，530 nm为发射波长（emission 1，绿色）来测定每个样品的绿色荧光，得到荧光值G。
25.以485 nm为激发波长，630 nm为发射波长（emission 2，红色）来测定每个样品的红色荧光，得到荧光值R。
26.计算每个样品的荧光比值G/R。
27.以1-5号样大肠杆菌活菌比为横坐标，以累积绿色荧光与红色荧光比（RatioG/R）为纵坐标，制作标准曲线，用待测样品G/R比值倒推出其活菌比。

五、荧光酶标仪检测（以大肠杆菌为例）
28.调整大肠杆菌活菌悬液和死菌悬液，使其密度均为1E8个细菌/mL（OD670=0.03）。
29.按下表制备标准曲线样本：
样本号    加入活菌mL    加入死菌mL    活菌比
1               0                         2                   0%
2               0.5                    1.5                  25%
3               1.0                    1.0                  50%
4                1.5                    0.5                 75%
5                2                       0                   100%
30.用0.85%NaCl溶液将测样品的细菌（死菌+活菌）浓度调到1E8个细菌/mL待用。
31.如果有N个待测样品，每个样品做三次重复，则需要准备3×（N+6）×100μL染料混合液B。多准备的5个用于标准曲线样品，1个为富余量。
32.染料混合液B配制（以1mL为例）：3 μL SYTO9溶液加3 μL PI溶液，再加入2 mL无菌水，充分混匀后即可。
33.每个样品各取100 μL悬液到一个96孔板中，每个样品做三个平行样（每个样品用三个孔）。96孔板的边缘孔空置以避免假读数。
34.更换新的枪头，每孔加入100 μL染色混合液B，上下吹打使充分混匀。
35.室温避光孵育15 min。
36.以485 nm为激发波长，530 nm为发射波长（emission 1，绿色）来测定每孔荧光，得到荧光值G。
37.以485 nm为激发波长，630 nm为发射波长（emission 2，红色）来测定每孔荧光，得到荧光值R。
38.计算荧光比值G/R。
39.以1-5号样大肠杆菌活菌比为横坐标，以累积绿色荧光与红色荧光比（G/R）为纵坐标，制作标准曲线，用待测样品G/R比值从标准曲线上倒推出其活菌比。

关联产品
SYTO9染料