CAT#:JW-11-230504
低温运输，-20℃保存

活细胞/死细胞双染试剂盒(钙黄绿素AM/PI法)

产品及特点
钙黄绿素乙酰甲酯（Calcein AM），CAS No:148504-34-1，一种具细胞膜渗透性的活细胞荧光染料，呈绿色荧光（Ex/Em=490nm/515nm）。AM基团的存在不仅加强疏水性，使其能轻易穿透活细胞膜。而且封闭结合钙离子的分子部分，本身不发荧光。一旦进入细胞后，被细胞内酯酶水解为钙黄绿素（Calcein），能与胞内钙离子结合，产生强烈的绿色荧光。因不具有细胞膜渗透性，从而被保留在胞内。与其它活细胞染料（如BCECF AM，CFDA）相比，Calcein AM最适合用于活细胞染色探针，因细胞毒性很低，而且不会抑制任何细胞功能如增殖或淋巴细胞趋化性。由于死细胞缺乏酯酶，Calcein AM仅对活细胞进行标记，这一特征使其非常适合用来检测细胞活力和细胞的短期示踪。Calcein AM常常与碘化丙啶PI联合使用，因其仅能穿过死细胞膜的无序区域到达细胞核，嵌入细胞的DNA双螺旋区域，并产生红色荧光（Ex/Em=535nm/617nm），仅对死细胞染色。由于Calcein AM和PI-DNA都可被490nm激发，因此可用荧光显微镜同时观察活细胞和死细胞。用545nm激发，仅可观察到死细胞。结合这些特征，Calcein AM和PI经常被结合用作活细胞和死细胞的双重染色。本试剂盒就是结合Calcein AM和PI的双重染料，来进行活细胞和死细胞的双重染色标记，从而进行活细胞和死细胞水平的分析。它具有下列特点：
1.可用荧光显微镜同时观察到活细胞和死细胞。
2.基本上适用于任何含酯酶活性的动物细胞。
3.其他相似的活细胞染料比较，Calcein AM基本无毒（毒性最小）。
4.使用Calcein AM活性检测的实验结果十分可信，与标准的51Cr释放法所得结果一致。
5.本试剂盒适用于荧光显微镜、流式细胞仪、荧光酶标仪或其它荧光检测系统。
6.本产品足够500次200 mL体系的细胞悬液进行染色。
7.本产品只可用于科研。

规格及成分
成分                                            编号          规格        包装
Calcein AM Solution(4 mM)    230504a    50 mL     0.5 mL棕色管
PI Solution(1.5 mM)                230504b    200 mL    0.5 mL棕色管
10×Assay Buffer                     230504c     50 mL      50 mL本色瓶
使用手册                                230504sc    1份           无
本产品采用小扁盒包装

运输及保存
低温运输，-20℃保存，保存期限为一年。

自备试剂
去离子水（dH2O）、细胞刮刀/胰酶-EDTA消化细胞、荧光显微镜/荧光酶标仪、激发滤片（490 nm、545 nm）、0.1%皂素/0.1-0.5%地高辛/70%乙醇

使用方法
一、1×反应缓冲液（Assay Buffer）的配制
1.从低温冰箱内取出10×Assay Buffer，根据单次用量无菌条件取出适量，用去离子水（dH2O）做10倍稀释以得到1×Assay Buffer。

二、1×染色工作液（Stain Buffer）的配制
2.先将低温保存的Calcein AM溶液（4 mM）和PI溶液（1.5 mM）室温回温至少20 min，使其充分融化。注意：第一次使用时建议对储存液根据单次用量分装，特别是Calcein AM，以减少反复冻融次数。
3.取5 mL Calcein AM溶液（4mM）和15 mL PI溶液（1.5mM）加入5 mL 1×Assay Buffer，充分混匀。此时得到Calcein AM的工作液浓度为4 mM，PI的工作液浓度为4.5 mM。由于不同细胞系的最佳染色条件不同，初次实验建议做梯度实验，以确定Calcein AM和PI的最适浓度。梯度筛选的原则为使用最低的探针浓度得到最好的荧光结果。注意：染色工作液必须现配现用，并且在当天用完。

三、染色步骤
4.对于贴壁细胞，先用细胞刮刀或者胰酶-EDTA消化细胞，之后离心收集细胞（1000 rpm，3 min）。对于悬浮细胞，直接离心（1000 rpm，3 min）收集细胞。
5.去上清，用1×Assay Buffer充分清洗细胞2~3次，以充分去除残留的酯酶活性。
6.用1×Assay Buffer制备细胞悬液，使其密度为10E5~10E6细胞/mL。
7.取100 mL染色工作液加入200 mL细胞悬液内，混匀，37℃孵育15 min。注意：如果需要，可延长孵育时间至30 min。
8.荧光显微镜下使用490±10 nm激发滤片同时检测活细胞（黄绿色荧光）以及死细胞（红色荧光）。另外，使用545 nm的激发滤片仅能观察到死细胞。也可以直接在荧光酶标仪下使用合适的滤片进行检测。
9.注意：可以使用以下方法来优化得到两种荧光染料的最佳工作浓度。用0.1%皂素或者0.1-0.5%地高辛孵育细胞10 min，或者用70%乙醇孵育细胞30 min，从而制备死细胞；用0.1-10 mM的PI溶液进行死细胞染色，以得到仅仅对细胞核染色，而不会对细胞质染色的最佳工作浓度;用0.1-10 mM的Calcein AM进行死细胞染色，以得到不会对细胞质染色的最佳工作浓度。然后用此浓度进行活细胞染色，去观察是否活细胞能被染色。

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